pmd19-t载体说明书

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1、 TaKaRa Code：TaKaRa Code：D102A pMD19-T Vector 说明书 宝生物工程(大连)有限公司 宝生物工程(大连)有限公司 目目 录录 内 容 Page 内 容 Page 制品说明 1 制品说明 1 制品内容 1制品内容 1 保 存 1保 存 1 纯 度 1纯 度 1 用 途 1用 途 1 pMD19-T Vector的结构 1 的结构 1 实验操作 2 实验操作 2 Control DNA 片段的克隆实验片段的克隆实验 2 2 一般一般 DNA 片段的克隆实验片段的克隆实验 2 2 相关说明 3 相关说明 3 使用注意 4 使用注意 4 Q&A 4 4 制品说

2、明制品说明 pMDpMD 19-T Vector是一种高效克隆PCR产物 （TA Cloning） 的专用载体。 本载体由pUC19 载体改建而成， 在pUC19 载体的多克隆位点处的 19-T Vector是一种高效克隆PCR产物 （TA Cloning） 的专用载体。 本载体由pUC19 载体改建而成， 在pUC19 载体的多克隆位点处的XbaXba I和 I和SalSal I识别位点之间插入了 I识别位点之间插入了EcoEcoR V识别位点，用R V识别位点，用EcoEcoR V进行酶切 反应后，再在两侧的 3端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物

3、 的 3末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 R V进行酶切 反应后，再在两侧的 3端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物 的 3末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 由于本载体以 pUC19 载体为基础构建而成，所以它具有同 pUC19 载体相同的功能。此外，本制品中的高 效连接液 Solution I 可以在短时间内（约 30 分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大 大方便了实验操作。本制品中的 Control Insert（500 bp）还可以用于

4、 Control 反应。 由于本载体以 pUC19 载体为基础构建而成，所以它具有同 pUC19 载体相同的功能。此外，本制品中的高 效连接液 Solution I 可以在短时间内（约 30 分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大 大方便了实验操作。本制品中的 Control Insert（500 bp）还可以用于 Control 反应。 本载体与pMD本载体与pMD 18-T Vector 相比，本制品的 -半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短， 菌落显示的蓝色更深。因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。 18-T Vector 相比，本制品的 -半乳糖苷酶的表达

5、活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短， 菌落显示的蓝色更深。因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。 制品内容制品内容 pMDpMD 19-T Vector（50 ng/l） 20 l1 支 19-T Vector（50 ng/l） 20 l1 支 Control Insert（50 ng/l） 10 l1 支 Control Insert（50 ng/l） 10 l1 支 Solution I* 75 l2 支Solution I* 75 l2 支 * 使用时请于冰中融解。 * 使用时请于冰中融解。 保保 存：存： -20-20 纯纯 度度 Control Insert 经克隆后的白色菌落中，有

6、 90%以上含有 Insert DNA 片段。 Control Insert 经克隆后的白色菌落中，有 90%以上含有 Insert DNA 片段。 用用 途途 进行 TA 克隆，克隆 PCR 产物。 进行 TA 克隆，克隆 PCR 产物。 对克隆后的PCR产物使用 对克隆后的PCR产物使用BcaBcaBESTBESTTM TM Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序。 Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序。 pMD19-T Vector的结构 的结构 pMD19-T Vertor (2,692 bp) -1- -1-

7、【pMD19-T Vector相关位点说明】 相关位点说明】 Cloning site Cloning site 431 431 BcaBcaBEST Sequencing Primer M13-47 binding site BEST Sequencing Primer M13-47 binding site 352375 352375 BcaBcaBEST Sequencing Primer RV-M binding site BEST Sequencing Primer RV-M binding site 484507 484507 LacZLacZ operator operator

8、146475 146475 ColE1 ori ColE1 ori 8731461 8731461 AmpAmpr r16322492 16322492 实验操作实验操作 Control DNA 片段的克隆实验片段的克隆实验 A）操作方法 A）操作方法 1）在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 51）在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 5 l。 l。 pMDpMD 19-T Vector*1 1 l 19-T Vector*1 1 l Control Insert*2 1 l Control Insert*2 1 l dHdH2 2O 3 l O 3 l 2）加入 5 l（等

9、量）的 Solution I。 2）加入 5 l（等量）的 Solution I。 3）16反应 30 分钟。 3）16反应 30 分钟。 注） 注） 室温（25）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 室温（25）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 4）全量（10 l）加入至 1004）全量（10 l）加入至 100 l JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 l JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 5）42加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。

10、5）42加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 6）加入 890 l SOC 培养基，37振荡培养 60 分钟。 6）加入 890 l SOC 培养基，37振荡培养 60 分钟。 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。 B）结 果 B）结 果 使用Control Insert时的连接/转化

11、结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.510使用Control Insert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.5108 8 cfu/g UC19 DNA。 cfu/g UC19 DNA。 p p Control Insert Control Insert 连接/转化效率 连接/转化效率 （cfu/g Vector） （cfu/g Vector） 白色菌落比率 （%）白色菌落比率 （%）效率（%）* 效率（%）* 2.8102.8106 696.3 96.3 90 以上 90 以上 2.2102.2105 540.2 40.2 0 0 * 效率是指白色菌落中的目的*

12、 效率是指白色菌落中的目的 DNA Insert 片段的连入效率。 片段的连入效率。 一般一般 DNA 片段的克隆实验 片段的克隆实验 1）在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 51）在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 5 l。 l。 pMDpMD 19-T Vector*1 1 l 19-T Vector*1 1 l Insert DNA*3 0.1 pmol0.3 pmol Insert DNA*3 0.1 pmol0.3 pmol dHdH2 2O up to 5 l O up to 5 l -2- -2- 2）加入 5 l（等量）的 Solution I。2）加入 5

13、 l（等量）的 Solution I。 3）16反应 30 分钟。 3）16反应 30 分钟。 注） 室温（25）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 注） 室温（25）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 长片段 长片段 PCR 产物（产物（2 kbp 以上）进行以上）进行 DNA 克隆时，连接反应时间请延长至数小时。 克隆时，连接反应时间请延长至数小时。 4）全量（10 l）加入至 1004）全量（10 l）加入至 100 l JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。

14、 l JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 5）42加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 5）42加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 6）加入 890 l SOC 培养基，37振荡培养 60 分钟。 6）加入 890 l SOC 培养基，37振荡培养 60 分钟。 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。 8）挑选白色菌落，使用 P

15、CR 法确认载体中插入片段的长度大小。 *1 *1 pMD19-T Vector的使用量 的使用量 取取 0.5 l实验也可得到满意的结果。实际操作时，可按实验需要确定实验也可得到满意的结果。实际操作时，可按实验需要确定T载体的使用量。载体的使用量。pMD19-T Vector 1 l（50 ng）的摩尔数约为）的摩尔数约为 0.03 pmol。 。 *2 *2 Control Insert Control Insert 为为 500 bp 的的 3末端带有末端带有 A 碱基的碱基的 PCR 产物，产物，Control Insert 1 l（50 ng）的摩 尔数约为 ）的摩 尔数约为 0.15 pmol。 。 *3 *3 Insert DNA 的使用量 的使用量 在进行克隆时，在进行克隆时，Vector DNA 和和 Insert DNA 的摩尔比一般为的摩尔比一般为 1 ：210。 。 相关说明相关说明 1. 感受态细胞的选择。 1. 感受态细胞的选择。 转化时请使用高效的热转化感受态细胞（转化效率110转化时请使用高效的热转化感受态细胞（转化效率1108 8 cfu/g pUC19） ，这样才可能得到比较理想 cfu/g pUC19） ，这样才可能得到比较理