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1、微生物微生物MALDI-TOF MS技术的 常规应用与开发 技术的 常规应用与开发 鲁辛辛 首都医科大学附属北京同仁医院 2 0 1 5 - 7 - 3 0 （第三届质谱继教） 鲁辛辛 首都医科大学附属北京同仁医院 2 0 1 5 - 7 - 3 0 （第三届质谱继教） 质谱及质谱及MALDI-TOF MS的基本原理的基本原理 MALDI-TOF MS的常规应用的常规应用 MALDI-TOFMS的开发应用的开发应用 血培养报警及体液直接鉴定血培养报警及体液直接鉴定 耐药性分析耐药性分析 同源性分析同源性分析 应用说明应用说明 主要内容主要内容 2 0 1 5 年上半年重要质谱新品介绍2 0 1
2、 5 年上半年重要质谱新品介绍 美国美国2015年上半年质谱年会：飞行时间质谱年上半年质谱年会：飞行时间质谱(TOF)创新研发超过过三 重四极杆质谱和其它类型质谱： 创新研发超过过三 重四极杆质谱和其它类型质谱： Waters行波离子淌度质谱：增加了碰撞截面值(CCS)的分离维度，其分离效果显 著提高，在蛋白质、多肽及复杂化合物异构体分析方面具有独特优势，还有AB Sciex、Agilent的离子淌度质谱 Thermo Fisher的Q Exactive GC四极杆串联轨道阱GC-MS/MS是第一款将气相色 谱和高分辨精确质量的Orbitrap质谱结合在一起的商业质谱，这是世界上首台气质 联用
3、Orbitrap质谱 日本电子的DART离子源的TOF整机和全二维气质 提高灵敏度研究，如Agilent和岛津的新款三重四极杆质谱（每年一款） 应用领域竞争激烈：组学研究、生物医药、食品安全和同位素标记方面 我国的采购仍以四极杆质谱为主我国的采购仍以四极杆质谱为主54%，TOF20% 我国质谱研发我国质谱研发 安捷伦安捷伦 Q-TOF 6545 日本电子日本电子AccuTOF-GCx 和和 AccuTOF-DART 4G 安捷伦安捷伦 LCMS-6470 岛津岛津 LCMS-8060 赛默飞赛默飞 Q Exactive GC 沃特世沃特世 Vion IMS Qtof厦门质谱厦门质谱 micro
4、Typer MS赛默飞赛默飞 Fusion Lumos Tribrid 1. 质谱及质谱及MALDI-TOF的基本原理的基本原理 质谱是一种与光谱并列的谱学方法，它通过制备、分离、 检测气相离子鉴定化合物的一种专门技术； 质谱是一种与光谱并列的谱学方法，它通过制备、分离、 检测气相离子鉴定化合物的一种专门技术； 质谱一次分析可提供丰富的结构信息，将分离技术与质谱 法结合是分离科学中一项突破性进展； 质谱一次分析可提供丰富的结构信息，将分离技术与质谱 法结合是分离科学中一项突破性进展； 因高特异性和高灵敏度得到广泛应用的普适性方法；因高特异性和高灵敏度得到广泛应用的普适性方法； 质谱仪是分离和检
5、测带电物质的质量差异的一类仪器，质谱仪是分离和检测带电物质的质量差异的一类仪器，由 样品导入系统、离子源、质量分析器、检测器、数据处理 系统等部分组成。 由 样品导入系统、离子源、质量分析器、检测器、数据处理 系统等部分组成。 续续 质谱分析是一种测量离子质荷比（质量质谱分析是一种测量离子质荷比（质量-电荷比，电荷比，M/Z）的 分析方法，由 ）的 分析方法，由Joseph John Thomson建立；建立； 使样本中各组分在使样本中各组分在离子源离子源中发生电离，生成不同质荷比的 带电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质 量分析器。在质量分析器中，利用电场和磁场发生相反的 速度色
6、散，将它们分别聚焦得到质谱图，从而确定质量； 中发生电离，生成不同质荷比的 带电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质 量分析器。在质量分析器中，利用电场和磁场发生相反的 速度色散，将它们分别聚焦得到质谱图，从而确定质量； 第一台质谱仪是英国科学家弗朗西斯第一台质谱仪是英国科学家弗朗西斯阿斯顿于阿斯顿于1919年制 成的。阿斯顿用这台装置发现了多种元素同位素，研究了 年制 成的。阿斯顿用这台装置发现了多种元素同位素，研究了 53个非放射性元素，发现了天然存在的个非放射性元素，发现了天然存在的287种核素中的种核素中的 212种，第一次证明原子质量亏损，为此荣获种，第一次证明原子质量亏损
7、，为此荣获1922年诺贝 尔化学奖。 年诺贝 尔化学奖。 有机质谱仪有机质谱仪 气相色谱气相色谱-质谱联用仪（质谱联用仪（GC-MS, gas chromatography）：气相 色谱 ）：气相 色谱-四极质谱仪、气相色谱四极质谱仪、气相色谱-飞行时间质谱仪、气相色谱飞行时间质谱仪、气相色谱-离子阱 质谱仪等； 离子阱 质谱仪等； 液相色谱液相色谱-质谱联用仪（质谱联用仪（LC-MS）：液相色谱）：液相色谱-四极滤质器质谱仪、 液相色谱 四极滤质器质谱仪、 液相色谱-离子阱质谱仪、液相色谱离子阱质谱仪、液相色谱-飞行时间质谱仪、以及液相色 谱 飞行时间质谱仪、以及液相色 谱-质谱质谱-质谱联
8、用仪；质谱联用仪； 其他有机质谱仪，如其他有机质谱仪，如:基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪 （ 基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪 （MALDI-TOF MS）、富立叶变换质谱仪（）、富立叶变换质谱仪（FT-MS）等。）等。 无机质谱仪无机质谱仪 火花源双聚焦质谱仪火花源双聚焦质谱仪 感应耦合等离子体质谱仪（感应耦合等离子体质谱仪（ICP-MS) 二次离子质谱仪（二次离子质谱仪（SIMS） 续 ） 续 基质辅助激光解析电离（基质辅助激光解析电离（MALDI）是由德国科学家）是由德国科学家Karas和和 Hillenkamp发明；发明； 将微量蛋白质与过量小分子基质混合液体点到样品靶上，经干 燥形成共
9、结晶，放入离子源内； 将微量蛋白质与过量小分子基质混合液体点到样品靶上，经干 燥形成共结晶，放入离子源内； 当激光照射到靶点上时，基质吸收了激光能量跃迁到激发态， 导致蛋白质电离和汽化，电离使基质的质子转移到蛋白质上； 当激光照射到靶点上时，基质吸收了激光能量跃迁到激发态， 导致蛋白质电离和汽化，电离使基质的质子转移到蛋白质上； 然后由高电压将电离的蛋白质从离子源转送到质量分析器内， 再经离子检测器和数据处理得到质谱图； 然后由高电压将电离的蛋白质从离子源转送到质量分析器内， 再经离子检测器和数据处理得到质谱图； MALDI-TOF MS的工作原理的工作原理 飞行时间质量分析器（飞行时间质量分
10、析器（TOF）被认为是与）被认为是与MALDI的最佳搭档， 因为二者都是脉冲工作方式，在质量分析过程中离子损失很少 ，可以获得很高的灵敏度； 的最佳搭档， 因为二者都是脉冲工作方式，在质量分析过程中离子损失很少 ，可以获得很高的灵敏度； TOF结果简单，容易换算，蛋白质离子在飞行管内的飞行速度 仅与它的 结果简单，容易换算，蛋白质离子在飞行管内的飞行速度 仅与它的(m/z)-1/2成正比，因此容易通过计算离子化蛋白质在 飞行管内的飞行时间，推算出蛋白质的 成正比，因此容易通过计算离子化蛋白质在 飞行管内的飞行时间，推算出蛋白质的m/z比；比； 与传统质量分析器相比，更易得到高分辨率和高测量精度
11、；速 度快，离子飞行时间仅为几个 与传统质量分析器相比，更易得到高分辨率和高测量精度；速 度快，离子飞行时间仅为几个s（1秒的百万分之一）和约秒的百万分之一）和约 100s之间；质量范围宽，可以直接检测到几十万道尔顿的单 电荷离子； 之间；质量范围宽，可以直接检测到几十万道尔顿的单 电荷离子； TOF被认为是被认为是21世纪最有前景的质量分析器。 续 世纪最有前景的质量分析器。 续 续续 X轴：M / ZX轴：M / Z Y轴：相对强度Y轴：相对强度 很直观的看到整个蛋白质分子的质谱全貌很直观的看到整个蛋白质分子的质谱全貌 质谱信号：质谱信号：分子离子峰分子离子峰、碎片离子峰、亚稳离子峰、重排
12、离子峰等、碎片离子峰、亚稳离子峰、重排离子峰等 续续 特征性质谱峰和质量图来自细菌全细胞蛋白（核糖体蛋白、 细胞膜蛋白）按照（ 特征性质谱峰和质量图来自细菌全细胞蛋白（核糖体蛋白、 细胞膜蛋白）按照（M/Z) 分离排列；) 分离排列； 鉴定数据库中已有细菌，质谱数据库质量直接关系鉴定的准 确与否； 鉴定数据库中已有细菌，质谱数据库质量直接关系鉴定的准 确与否； 数据库建库形式基本为标准菌株数据库建库形式基本为标准菌株+临床分离株共同取临床分离株共同取MS峰计 算所得； 峰计 算所得； 目前目前Bruker含含2290种、种、5627个细菌与真菌种属；个细菌与真菌种属； Bruker可自建数据库
13、、自建方法、开发药敏及毒素检测等。 续 可自建数据库、自建方法、开发药敏及毒素检测等。 续 续续 鉴定分值（匹配分值）从0 到3 ，表示鉴定分值（匹配分值）从0 到3 ，表示不可信、可信和完全 可信 不可信、可信和完全 可信。当鉴定分值1 . 7 表示鉴定结果与数据库谱图高度匹 配；当鉴定分值 1 . 7 表示结果不可信。 。当鉴定分值1 . 7 表示鉴定结果与数据库谱图高度匹 配；当鉴定分值 1 . 7 表示结果不可信。 RangeDescriptionSymbolsColor 2.3003.000highly probable species identification (+)Green
14、 2.002.299secure genus identification, probable species identification (+)Green 1.7001.999probable genus identification (+)Yellow 0.0001.699no reliable identification (-)Red 续续 准确、迅速、廉价、微量、高通量、智能、多功能准确、迅速、廉价、微量、高通量、智能、多功能 快速给出抗生素选择快速给出抗生素选择 无论什么标本均可直接分析无论什么标本均可直接分析 无论什么病原体均能迅速确认无论什么病原体均能迅速确认 可进行致病机制
15、与遗传学研究可进行致病机制与遗传学研究 能开展病原流行病学研究能开展病原流行病学研究 质谱能实现吗？质谱能实现吗？ 微生物诊断技术的发展趋势微生物诊断技术的发展趋势 2. MALDI-TOF MS常规应用常规应用 质谱前处理：质谱前处理： 方式一 蛋白提取方法：方式一 蛋白提取方法： （1）蛋白质提取：5 u l 乙腈+ 5 u l 甲酸+ 菌落 少许研磨震荡点靶待干 （ ）蛋白质提取：5 u l 乙腈+ 5 u l 甲酸+ 菌落 少许研磨震荡点靶待干 （2）基质液配置：）基质液配置：10%三氟乙酸三氟乙酸+70%乙腈 按 乙腈 按1:3的比列溶解溶质的比列溶解溶质（-腈基腈基-4-羟基肉桂
16、酸 羟基肉桂 酸(HCCA)制成过饱和溶液，点样干燥后制成过饱和溶液，点样干燥后 +1ul基质干燥后上机；基质干燥后上机； 方式二 直接点靶方法：方式二 直接点靶方法： （1）少量菌落涂靶干燥）少量菌落涂靶干燥+基质基质1ul干燥上机 （ 干燥上机 （2）先加少许纯乙腈）先加少许纯乙腈+少量菌落干燥少量菌落干燥+1ul 基质干燥上机，可改善酵母样真菌、棒状杆 菌或分枝杆菌鉴定 基质干燥上机，可改善酵母样真菌、棒状杆 菌或分枝杆菌鉴定 3 4 3 6 d a t o u 0 : O 1 3 M S , S mo o t h e d , B a s e l i n e S u b t r a c t e d 0 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 4 0 0 0 5 0 0 0 6 0 0 0 I n t e n s . a . u . 2 0 0 04 0 0
