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1、色氨酸代谢产物对肝癌细胞的作用,姓名:专业：消内科,立论依据,一 研究意义 （1）原发性肝细胞癌（HCC）是我国常见恶性肿瘤之一，在消化道肿瘤中，其发病率仅次于胃癌。目前肝癌的治疗，除手术治疗外，化疗、放疗、生物和免疫治疗等多种治疗措施的综合运用，为提高患者生存率起到了积极的作用。但是至今，并没有找到根治肝癌的有效方法。,(2)自 Tayor等提出IFN-对肿瘤生长的抑制作用是其诱导色氨酸代谢所致的观点后，与色氨酸分解代谢有关的酶吲哚胺2，3双加氧酶（IDO）和肿瘤的关系开始倍受关注。,近期的研究发现，在不同类型的肿瘤中，IDO可以扮演完全不同的角色。,在急性髓细胞样白血病、黑色素瘤等肿瘤中，
2、IDO可以通过抑制T细胞，从而促进肿瘤的生长；而在肝癌等肿瘤中，IDO的存在可以提高机体的抗癌细胞作用,目前这一作用的具体机制尚不十分清楚。,（3）IDO是色氨酸分解代谢的限速酶，对色氨酸沿犬尿酸途径进行分解起到了重要作用。 IDO在多种组织中有表达，在感染、肿瘤、器官移植、自身免疫性疾病以及妊娠期间，IDO的活性增强，加速色氨酸的分解。脂多糖（LPS）、IFN-等细胞因子能够诱导巨噬细胞、树突状细胞等表达IDO。,IDO的分子式为：,NH2 O NH2 OH O IDO为偏脂溶性物质，可溶解于DMSO溶剂中。,IDO催化反应如下： 色氨酸,IDO N-甲酰尿氨酸,甲酰胺酶 L-犬尿素,犬尿素
3、3-羟化酶 犬尿素酶 3-羟基犬尿酸 邻氨基苯甲酸,犬尿素酶 非特异性羟化 羟基氨基苯甲酸,氧化酶 喹啉酸,二 国内外研究现状：,Ishio T等在体外培养实验中发现，外周单核细胞加入肝癌细胞株HepG2或PLC/PRF/5共同培养后，可显著诱导单核细胞中IDOmRNA的表达。外周单核细胞抗肝癌细胞的细胞毒性作用正好与IDOmRNA的表达水平成正比，加入IDO的抑制剂1-甲基色氨酸（1-MT）后可以降低细胞毒性作用。IDO阳性的肝细胞癌病人在肝切除术后，无复发生存率高于IDO阴性的患者。,二 国内外研究现状：,Kai S等证明IDO可以增强NK细胞杀伤K562细胞(慢性髓性白血病细胞系)和He
4、pG2细胞的功能。给与1-MT可以降低老鼠NK细胞毒素的活性。,二 国内外研究现状：,Guido Frumento 等证明L-犬尿素、邻吡啶甲酸和喹啉酸等色氨酸代谢产物可以抑制某些淋巴细胞的增殖。此效应在色氨酸缺乏时更为明显。 Dariusz Pawlak 等发现喹啉酸在1000M/L浓度水平上可以降低HepG2细胞的活性。,二 国内外研究现状： 总之，IDO抗肝癌细胞的作用机制尚处于摸索阶段，还有许多值得研究的地方。本课题将主要研究色氨酸在IDO催化下分解生成的几种代谢产物对肝癌细胞的生长和凋亡有何影响。,研究方案,一 研究目的 观察色氨酸经IDO催化后分解生成的各种代谢产物的量及其代谢产物
5、对肝癌细胞的生长及凋亡的影响，为临床治疗肝癌提供新思路。,二 研究内容 高效液相色谱法测定色氨酸代谢产物的量。 肝癌细胞的培养。 MTT法测定代谢产物对HepG2细胞的增值的抑制作用及色氨酸缺乏对这一作用的影响。 流式细胞术观察代谢产物对肝癌细胞细胞周期的影响。,三 拟解决的关键问题 1 HepG2细胞的培养 2 从细胞水平来验证色氨酸的代谢产物对肝癌细胞是否有抑制增殖、周期阻滞、诱导凋亡的作用。 3 各代谢产物浓度范围及作用时间的选定均为本试验的技术关键 4 利用高效液相色谱法对色氨酸的代谢产物进行定量分析,四 技术路线(第一步） 。 HepG2细胞株 体外培养 细胞浓度达到104/ml 分
6、0.1,1,10，100，1000 M/L浓度加入代谢产物 12h,24h,36h,48h后分别检测 MTT法 HepG2细胞抑制率 统计学分析,四 技术路线（第二步）,。 HepG2细胞株 体外培养 细胞浓度达到104/ml 分0.5,5,50，500，5000 M/L浓度加入IDO 12h,24h,36h,48h后分别检测 MTT法 HPLC法 HepG2细胞抑制率 各代谢产物的量 统计学分析 .,四 技术路线（第三步）,HepG2细胞株 体外培养 细胞浓度达到104/ml 根据统计学分析结果加药，作用一定时间 离心沉淀后收集细胞调整细胞浓度为5* 106/ml 流式细胞术 细胞周期的变化
7、 分析结果,六 实验方案 1 细胞培养：HepG2细胞株在DMEM培养液中传代培养。 2 加药：将培养好的HepG2细胞进行胰酶消化，制成104/ml单细胞悬液，置于反应板内，同时加药,(1)选定三种代谢产物（L-犬尿素、3-羟基犬尿酸、喹啉酸）进行试验。 色氨酸充足的条件下（30M/L）,将每种代谢产物分（0.1，1,10，100，1000 M/L） 5个浓度梯度，(12h,24h,36h,48h)4个反应时间，用MTT法测细胞抑制率。绘制时间关系曲线。 另设色氨酸空白组为对照组,(2)色氨酸充足的条件下（30M/L）加入IDO，分（0.5，5,50，500，5000 M/L） 5个浓度梯度
8、(12h,24h,36h,48h)4个反应时间，测细胞抑制率。 并用高效液相色谱法（HPLC）测出三种代谢产物（L-犬尿素、3-羟基犬尿酸、喹啉酸）生成的量。,3 流式细胞术测定细胞周期：选取某个代谢产物最佳反应浓度和反应时间离心收集细胞，然后调整细胞为5106/ml，处理后24h内上机分析。,4 统计学分析：统计描述：均数标准差表示，析因设计的方差分析，样本之间比较用SNK-Q检验和t检验，P0.05有统计学意义。数据分析采用SPSS11.0软件。,本课题的创新之处,首次将色氨酸在IDO的催化下分解生成的代谢产物单独作用于HepG2肝癌细胞株，探讨IDO抗肝癌细胞的作用机理，进一步研究其对肝
9、癌的潜在治疗价值，并借此寻找肝癌治疗的新途径。,研究计划及预测进展,2007年3月底之前：在导师的指导下，查阅国内外文献资料，反复论证该课题的可行性、科学性、创新性；全面了解及掌握所需要的试剂等。 2007年4月开始进行预实验，及时解决碰到的具体问题，并撰写综述。 2007年6月后开始正式实验，做好实验纪录。 2007年10月争取完成实验。 2007年11月后整理实验纪录，做统计学处理，撰写科研论文。,预期研究成果,预计试验结果为色氨酸代谢产物对HepG2细胞有抑制增殖, 调节细胞周期的作用,该作用随药物浓度和时间的增加而增强。色氨酸代谢产物有诱导细胞凋亡的作用。色氨酸代谢产物在肝癌治疗上有潜
10、在价值。,在充分的理论，成熟的实验条件，认真仔细的工作之后，相信能得到满意的结果。即使结果可能不尽人意，也会给以后的研究工作以宝贵的启示。,研究基础,一 学术条件： 我院消化科有自己的实验室及科研经验丰富的博士生和硕士生导师进行指导。 上几届研究生和导师王琦教授在肝癌有关方面作了大量的基础性研究工作，积累了丰富的理论知识和实践经验。,二 实验条件 我院实验室和山西医科大学实验室具备专业的技术人员和所需的各种仪器设备，具有多年的细胞培养经验，色谱法、MTT法、流式细胞术均已成熟，可以确保实验顺利完成。 三 所需经费已基本落实。,经费预算,主要参考文献： 1. Ishio T, Goto S, T
11、ahara K,et al.Immunoactivative role of indoleamine 2,3-dioxygenase in human hepatocellular carcinomaJJournal of Gastroenterology and Hepatology2004 Vol 19,319-326 2. Kai S, Goto S, Tahara K,et al.Inhibition of indoleamine 2,3-dioxygenase suppresses NK cell activity and accelerates tumor growthJ.Jour
12、nal of Experimental Therapeutics and Oncology 2003,3:336-345. 3. Kai S, Goto S, Tahara K,et al. indoleamine 2,3-dioxygenase is necessary for cytolytic activity of natural killer cellsJ.Scandinavian Journal of Immunology. 2004,59:177-182,4.Guido Frumento,Rita Rotondo,Michela Tonetti,et al.Tryptophan-
13、derived catabolites are responsible for inhibition of T and natural killer cell proliferation induced by indoleamine 2,3-dioxygenase.JJ.Exp.Med,2002,196(4):459-468. 5. Fallarino F, Grohman Un, Vacca C,et al.T cell apoptosis by tryptophan catabolismJ.Cell Death and Differentiation,2002,9,1069-1077. 6
14、. Dariusz Pawlak,Mariusz Koda,et al.Contribution of quinolinic acid in the development of anemia in insufficiency JAm J Physiol Renal Physiol 2003,284:693-700,7.Tang XQ,Zhao ZG,Wang HX,et al. Indoleamine 2, 3-dioxygenase activity in acute myeloid leukemia cells contributing to tumor immune escapeJ Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2006 Jun;14(3):539-42 8.Zheng X, Koropatnick J, Li M,et al. Reinstalling Antitumor Immunity by Inhibiting Tumor-Derived Immunosuppressive Molecule IDO through RNA InterferenceJ. , 2006 Oct 15,177(8):5639-46,谢谢各位老师！,
