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1、本资料来源,谢沐风 上海市食品药品检验所 ,原料药注册与生产现场检查培训班,请大家将手机调至“振动”档！ 谢谢您的配合！,工 作 简 历, 1998年至今 在本所化学室工作。经历了 “1998年2002年的强仿期”和“20032006仿制药疯狂期” 2003年8月 2004年2月 赴日本国立医药品食品卫生研究所药品部（相当于我国中检所化药室）进修。 发表了多篇方法类、思路类文章，引起业内瞩目与同仁共鸣。 (1) 如何建立HPLC(TLC)法测定有关物质方法； (2) 如何建立HPLC法测定含量方法；, 与企业和研发公司交流经历 走访/核查过全国上百家制药企业； 时常与同仁们相互交流、切磋； 深
2、谙目前国内制药企业技术现状与薄弱环节。 2009年伊始、在国内知名药学网站 丁香园“药物制剂版”上创立“溶出度研究”子版，引起业内瞩目。,我们已经走得太远，以至于忘记了为什么而出发。 黎巴嫩著名诗人纪伯伦（18831931）,工 作 感 悟,本 人 体 会, 工作中一定要注重思考，带着问题去学习、有的放矢地去攻读，多观察、多领会，日积月累、潜移默化之中就会水到渠成。 思维要开放、活跃，不要固步自封、按部就班，因循守旧。 一定要不断思考，注意查询文献，收集各方面信息，培养自身的专业素养与专业敏感度，不要怕遇到问题，越是遇到问题、将其解决，就越能不断提高与进步。,注重培养个人的专业素养与敏感度,切
3、忌：闭门造车、闷头蛮干！,很荣幸此次来到京城与各位同仁相互交流、学习！ 感谢国家药监局培训中心搭建平台！, 寄望大家多思考、多提问！ 寄望能学以致用，为大家工作献计献策、呈上绵薄之力！,【溶解度】 会因结晶溶剂的不同导致结果的差异性，一般不做硬性规定，酌情处理。只是操作时样品一定要研细后进行。 【晶型】 如研究表明：各晶型具有相同表观溶解度，或者各晶型皆易溶于水，此时各晶型一般不会影响药物的体内生物利用度，便无需拟定。 如各晶型具有不同表观溶解度，即有属于低溶解性的晶型，此时则应在质量标准中拟定晶型检测。一般采用X-射线衍射法。有时亦能采用红外予以明辨。 列举质量标准中已有拟订的“阿德福韦酯”
4、和“那格列奈”实例。（仪器校正）,【红外鉴别】 观测2500cm-1 - 400cm-1波数段间8大主峰波数。峰间高低可以不一。 个别小峰允许存在，是杂质存在的体现。 【荧光分析法】 响应值不稳定，有时会波动较大，不建议使用。,【熔点测定法】 试验结束后切勿立即切断电源，设置为室温，使其自然降温，之后再关闭电源。 熔距越短或终熔点越接近高限、纯度越高。 【紫外-可见分光光度法】 比色法测定时、一定要平行操作，测定时迅即完成，切忌等待吸收度值稳定后再行记录！,【旋光度测定法】 温控尤为重要！先将溶剂置于该温度水浴中，随后采用该溶剂快速配制溶液，定容后立即测定。 【氧瓶燃烧法】 样品一定要燃烧完全
5、。若氧气充满、尚无法燃尽，可将样品量减半，在其后的测定中再将浓度增加一倍，即可。,【溶液的澄清度与颜色、氯化物、硫酸盐、重金属检查等】 建议配制梯度对照液，这样可对样品进行一个全面、综合分析。 【炽灼残渣检查法】 炽灼后放置于干燥器内的时间不得少于1小时，否则称重不稳。 【崩解时限】 胶囊剂有时会出现胶囊壳存留于网底的情况，可将囊壳取出，若其中无内容物，亦可判断为合格。,【干燥失重和水分】,(1) 一些缓慢降解的物质、不易采用恒重，规定时间。一般105、3小时肯定已可以！ 典型案例盐酸西布曲明，见下。 (2) 带有结晶水的药物，尽量采用卡氏法测定。,其中的环丁基较为“脆弱”，不断缓慢分解。应采
6、用卡氏法测定。,残留溶剂研究思路, 研究原则：合成过程中使用到的有机溶剂均需建立测定方法、并予以研究测定。 观测样品测定结果：申报3批样品测定结果说明工艺稳定性。 质量标准拟定原则：除第一类溶剂外、“未检出的溶剂”可以不拟定，仅拟定最后一步重结晶溶剂。 测定方法：根据研究检测结果，质量标准方法完全可以与研究时方法不同。,残留溶剂研究思路, 质量标准拟定原则：如仅残留有重结晶溶剂、且为低沸点（如乙醇、丙酮等），完全可采用105干燥失重方法予以替代。从而省略掉气相测定，且干燥失重限度可酌情放宽。 质量标准是一个不断完善的过程： 列举“自套枷锁”、“事倍功半”实例！ 列举阿法骨化醇无需研究测定实例！
7、,气相色谱法测定时应注意事项(1) 强烈建议男同志从事此项工作。 将对照品溶液浓度配制为限度点。 对于二氯甲烷、三氯甲烷采用氢火焰检测器(FID)勉为其难、应采用电子捕获检测器(ECD)。如要强行检测，可采用的办法有：直接进样、加大流速，使峰形便尖锐、从而提高峰面积积分精密度。 供试品溶液一定要全部溶解。 对于一些高沸点和低沸点的残留溶剂，不推荐采用顶空法进样！ 尽可能建立内标法、而非外标法。,气相色谱法测定时应注意事项(2) 对照品溶液配制法（引申至对照品为油状时）。 直接进样法与顶空法的优缺点比较。 定性时、多根色谱柱使用的意义。 色谱柱选择的一定要遵循“极性相似”原理。 直接法进样样品溶
8、液后，进样针极易堵塞。自动进样器时设定几针溶剂，冲洗时多洗几次。试验结束后用乙醇浸泡进样针。,容量分析法测定含量,(1) 滴定液的标化与贮藏 氢氧化钠滴定液标化后一定要分成小塑料瓶、密闭包装。使用时，酌情（针对放置时间和样品之类）再标化一份即可。因其极易吸收空气中的二氧化碳，使校正因子降低，消耗过多滴定液，从而使结果偏高，有时会出现高于101.0%情况。 高氯酸滴定液应临用现标。使用当天标化三份，取均值即可。 不常用滴定液建议购买，如甲醇钠滴定液等。,容量分析法测定含量,(2) 滴定液的消耗体积 针对不同消耗体积采用不同规格滴定管(10/26/50ml) 对于消耗量小于误差要求的最小体积时，可
9、采用稀释滴定液、增加消耗体积的办法；或采用电位滴定仪。 (3) 指示剂使用注意点 部分指示液配制后，如放置时间过久，其变色会迟钝，导致消耗体积过大，结果偏高；故配制后酌情放入冰箱中。,容量分析法测定含量,(4) 操作中的注意事项 对于采用指示剂法测定的操作，只要有空白试验，样品变色后的色泽一定要与空白色泽一致，以消除系统误差。 (5) 容量分析法与HPLC法介绍（引申至对照品质量标准） 容量分析法：专属性差、人为因素较强；但省时省力。 HPLC法：专属性强；但定量结果会因波长不同存在较大偏差，因杂质与主成分的响应因子不同,电位滴定法测定含量, 对于指示剂变色难以辨明时 样品溶液变色存在干扰（有
10、辅料或沉淀存在等） 消耗体积很少、无法采用滴定管定量。 杂质和主成分对照品的标化方法。 设定的滴定参数应使滴定曲线呈现平滑，以避免滴 定终点的误判。即如何确定合适的“阈值”：先全程滴 定，根据突跃变化情况，确定阈值后再次滴定，尤其 是进行两个突跃点的滴定时（引申至新版药典）。,高效液相色谱法应用时经常出现的问题, 柱温箱一定要配制。试验温度建议在30-50。清洗温度可高于试验温度5。 色谱柱清洗： 对于正相、实验结束用流动相再冲洗半小时即可。 对于反相，除非流动相采用单纯的甲醇/乙腈-水，其他所有流动相皆建议先用纯水冲洗半小时（流速1.0ml/min），再改用20%甲醇冲洗半小时，随后取下、两
11、头密闭即可。绝不推荐, 液相色谱仪：绝不建议为节约乙腈/甲醇，而采用两个泵，将水相与有机相分别注入混合的方式（即便配置了脱气机）。一定要将两相按比例混合后脱气过滤，采用一个泵注入，且清洗时一定就清洗使用泵，不建议采用另一个泵将清洗液注入（重点讲述！） 过滤膜一定要采用混相膜。 正相流动相无需过滤、混合均匀后超声即可。,高效液相色谱法应用时经常出现的问题, 梯度洗脱时 最理想方式： A相位高比例的水相兑低比例的有机相；B相为低比例的水相兑高比例的有机相； 其次：A相位高比例的水相兑低比例的有机相；B相皆为有机相。 绝不建议A相位纯水相、B相位纯有机相，即便质量标准如此拟定，采用一元一次函数，将其
12、转换成第二种情况，否则极易出现基线飘动、无法准确积分的现象。,高效液相色谱法应用时经常出现的问题, 梯度洗脱时，必须先行测定空白溶剂峰，应基线平稳、溶剂峰出峰在前。确认色谱柱内清洗干净后再测定样品。 以确保有关物质检测时，杂质的准确测定。,高效液相色谱法应用时经常出现的问题,高效液相色谱法测定含量,(1) 对照品溶液配制2份（2份粉末） 分别进样3针，计算校正因子f=C/A，随后计算f的RSD，小于2.0%即认为2份对照品溶液配制均无误、且仪器已稳定。取f均值测定样品。 (2) 样品溶液亦配制2份，每份进样一针，两份百分含量差值在2.0%以内即可。,高效液相色谱法测定含量,(3) 待全部样品检
13、测结束后（无所谓n针，即便运转了一天、亦无须担忧），任取一份对照溶液回进一针，计算含量（浓度），应在理论浓度偏差的2.0%以内，便可确保检测过程中仪器性能的稳定。 (4) 如原方法为内标法，秉承药审中心提出的“仿产品不是仿标准”理念，一定要改为外标法！除非前处理极为繁琐、较易损失时。,含量测定浓度和色谱条件如何建立 浓度不要与有关物质浓度一致；一般为1/101/50。便于过滤（对于制剂）、杂质干扰减少、积分准确。 色谱条件可与有关物质不一致（如有关物质为梯度洗脱或保留时间很长），更加科学化、人性化。 波长不是最大吸收波长亦可、选用末端吸收。 要注意样品粉末占有一定体积时引起的误差。,薄层色谱法
14、测定有关物质,(1) 尽可能使用商品化薄层板、不建议自行铺制。 (2) 设置梯度对照(1.0%、0.5%、0.2%和0.1%，通过点样量来实现，方便快捷、事半功倍)；实现“半定量”。 (3) 0.1%斑点如显现不出，加大点样量。 (4) 主斑点如超载、“断腰”，可适当减小点样量。 (5) 显色剂尽可能新鲜配制。 (6) 观测时，建议增加翻转观测，即透过玻璃面观测。,高效液相色谱法测定有关物质,(1) 每批样品配制1份，即可。 (2) 多批样品同时检测时，选用粉末量最少的样品稀释制成自身对照溶液即可，绝对无需每一样品均稀释成自身对照溶液。 (3) 对照溶液连续进样3针，计算主峰峰面积的RSD，小
15、于2.0%即认为仪器稳定、积分无误。取峰面积均值用于样品杂质峰比较。,高效液相色谱法测定有关物质,(4) 测定空白溶剂（梯度洗脱时一定要先行测定） (5) 每一样品进样一针，对杂质峰进行积分。积分时注意事项： 最小峰面积：设定为对照溶液主峰面积的1/10-1/50（讲述原理） 斜率与峰宽：与对照溶液积分参数相同。 技巧：对照溶液稀释后，若主峰面积呈线性（一般均呈线性），归一化法计算结果与自身对照法测定结果基本一致（相差在0.02%以内），可用归一化直接观测。,方法学验证中各项指标的深度剖析,一、线性试验,主成分含量测定 以测定浓度为100% ，50%120%之间选取5个点即可。 溶出（释放）度
16、测定 以释放量的10%120%间选取5个点即可。 杂质含量用杂质对照品准确测定 以杂质限度为100% ，50%120%之间选取5个点即可。,测定结果： 1）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。 2）误差在哪里，应用时的注意事项。 3）为什么没有不成线性的？通常C、H、O、N结构，紫外监测器决定。 个别化学键所致。梯度洗脱时，有时会出现不成线性。 4）都成线性、为何还要做？最小二乘法的原理知晓。何种情况不呈线性？,唑 来 磷 酸 结 构 式,不呈线性情况： 1）分子结构式怪异，如唑来膦酸。 2）梯度洗脱，所以此时规定柱效无意义。 3）主成分在色谱柱上几乎无保留，保留时间为“死时间”（如氢溴酸右美沙芬的测定） 4）浓度过高时、检测器或色谱柱超载。
