《leicasp8激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册2013-5-13》由会员分享,可在线阅读,更多相关《leicasp8激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册2013-5-13(21页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、1 Leica 激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜 快速操作手册快速操作手册 制作:徕卡显微系统(上海)贸易有限公司制作:徕卡显微系统(上海)贸易有限公司 2013 年年 3 月月 2 目录:目录: 1 系统的组成系统的组成 系统组成系统组成.3 光路示意图光路示意图.4 2 系统的使用系统的使用 2.1 开机顺序开机顺序.5 2.2 软件软件界面简介界面简介.7 2.3 在显微镜下观察样品在显微镜下观察样品.8 2.4 采集共聚焦图像采集共聚焦图像.9 2.5 XYZ三维扫描(三维扫描(Z-Stack)11 2.6 时间序列扫描(时间序列扫描(Timeseries or xyt Sca
2、n)15 2.7 波长扫描(波长扫描(xy Scan)16 2.8 HyD检测器检测器.17 2.9 图像的保存及输出图像的保存及输出.18 2.10 关机关机.20 3 系统的维护系统的维护.21 3 Leica SP8 系统组成图系统组成图 4 1 1 可见波长激光或白激光 1515 UVIS, HIVIS或VISIR的光路镀膜 2 2 声光调制器(AOTF) 1616 扫描视场旋转镜(Abbe-Konig 旋转)* 3 3 红外激光(IR)* 1717 在NND位置上的反射光检测器(RLD)* 4 4 电光调制器 1818 物镜(可提供各种选择)* 5 5 紫外激光* 1919 在NND
3、位置上的透射光检测器(TLD)* 6 6 AOTF或直接调制器(DMOD) 2020 正方型针孔 7 7 STED 激光* 2121 Fluorifier盘* 8 8 Setlight监控二极管 2222 X1出口接口* 9 9 AOBS, 及其他选配件 2323 外置检测器* 1010 用于FRAP的光束增强镜* 2424 色散棱镜 1111 红外激光耦合 2525 分开的荧光光谱 1212 与CS2紫外光路耦合的紫外激光 2626 最多5个光电倍增管或4个HyD检测器 1313 STED激光耦合 *选配组件 1414 全视野扫描镜及串行高速扫描镜选件 5 2 系统的使用系统的使用 2.1
4、开机顺序开机顺序 (硬件标号请参考前面的系统组成图) (1)因为 FSU 和 CSU 硬件的电源控制 )不同,请分别按照如下步骤开机: FSU 系统系统 CSU 系统系统 依次打开 “PC Microscope” 、“Scanner Power” 、 “Laser Power” 三个按钮, 将 “Laser Emission” 上的激光开关钥匙旋至“On-1 注意:显微镜控制器的开关 一般是常开 的,在打开“PC Microscope”按钮后指示灯 应该点亮,如果不亮,请打开其开关。 先按电脑主机上的电源按钮启动电脑,再打 开显微镜控制器 的开关,然后依次打开 “Scanner Power”
5、、 “Laser Power”两个按钮, 将“Laser Emission”上的激光开关钥匙旋至 “On-1 之后两个系统的操作一样 (2)打开荧光激发光源 (按绿色的 Power 按钮,如右图) 光源亮度调节旋钮光源亮度调节旋钮 光闸光闸 Power 按钮按钮 6 (3)电脑进入操作系统界面后,双击电脑桌面“LAS AF”图标启 动共聚焦操作软件。 ( 4 )进 入 配 置 选 择 界 面 后 , 在 “Configuration”下拉菜单中选择需要的 配置; (其中带有“simulator”字样的为模 拟方式,该方式不控制显微镜硬件,不能 拍摄图像,适合处理数据) “Microscope”
6、 菜单中选择显微镜型号;(图中 “Resonant” 选项为快扫功能,可按需要打开或关闭, 只有配备了快扫功能的系统才会显示该 选项) ,点击“OK” ,系统继续启动。 (5)在“Initialize Stage”提示界面选择是 否初始化载物台 (如果选择 “No” , 则 Tile scan、 Mark&Find 和 Matrix 功能不能使用) 。 注意:如果配置的是手动载物台,则不 会跳出该提示界面。 (6)系统自检完后, 进入 LAS AF 操作界面, 点击界面最上方“Configuration”按钮进入配置界面点击左边“Laser Config” 按钮打开所需激光 (OFFON) ,
7、 Argon 激光还需拖动右方滑块以调节激光输出 功率 7 2.2 软件界面简介软件界面简介 功能界面切换:参数设定(Configration) 、扫描取图(Acquire) 、图像处理(Process) 、 定量测量(Quantify) 工具和文件管理界面切换:Experiments 界面下显示当前拍摄和打开的图片, Acquisition 下显示的是当前功能界面的功能按钮和参数 拍摄参数:包括图像像素 Format、扫描速度 speed、图像放大 Zoom factor、视野旋转 Rotation 等。 三维扫描工具组,用于设定和显示三维扫描的 Z 轴范围,及其他辅助设定 光路显示及设置区
8、域, 从上向下直观显示了从激发到荧光检测的光路细节和关键设置 图像显示窗口 预设光路选择按钮 激光控制栏 分光镜选择按钮 物镜选择按钮 预览按钮,可用于开始和停止预览 拍摄图像按钮 叠加图像显示按钮,在使用两个或以上数量通道拍摄多色图像时,用于显示所有通 道叠加后的图像 界面缩放调节滑块,左右拖动可以调节界面项目的显示比例 界面调整栏,左右拖动可调整光路设置区域与图形显示窗口的范围 8 2.3 在显微镜下观察样品在显微镜下观察样品 2.3.1 选择物镜: 可通过显微镜主机右侧右侧的物镜转换按钮, 或软件中的 “Objectives” 按钮进行选择(如下图) 。 (在显微镜设置软件 Leica
9、AF Hardware Configurator 中可设定最下方的红圈中的按钮为干/油镜转换,在干/油镜之间切换时需要先按 一下此按钮才能完成转换) 2.3.2 明场观察: 将样品置于载物台上, 按显微 镜左侧左侧的TL/IL 按钮打开明场光路 (如右图)(因 显微镜所处状态不同,有时候需要按两次才能 打开) ,在明场条件下选择合适的视野。通过 调焦按钮或旋钮调节至合适的 z 轴平面,通过 显微镜主机左侧的“INT”功能键调节光强。 如果是电动载物台,需通过遥控手轮调节 载物台的运动以选择合适的视野(如下图) 。 2.3.3 按显微镜前面板的荧光滤块选择按 钮切换至荧光观察光路 (如右图所示)
10、 , 其 上的标注与荧光颜色的对应关系为:I3 - 绿色,N2.1-红色,A蓝色,有些配置的 显微镜按钮对应的荧光颜色可能会有所不 同,请以实际情况为准。 再按荧光光闸按钮(SHUTTER)打开 荧光,进行样品的荧光观察。 2.3.4 观察完毕后,按显微镜前面板上的 9 “SHUTTER”按钮以保护样品 2.4 采集共聚焦图像采集共聚焦图像 2.4.1 光路设置: 调用已有的设置:选择“Load/Save single setting”下拉菜单中已有的设置,激光波长及 其输出功率、分光镜、检测波长范围、检测器 gain 及 offset 都会自动设置,包含几种最常用 的荧光染料。选择某一设置后
11、,可按样品的实 际情况对参数进行优化(如后述) ,并以新的 名称保存。 (如右图) 修改已有设置:可改变所选激光、调节激 光输出功率、改变分光镜、改变所选 PMT、调 节 PMT 检测范围、 调节 PMT 的 gain 或 offset 等。如下图。 建立新的设置:也可从零开始建立新的设置。选择所需激光及其功率、 适宜的分光镜、检测器及检测波长范围。 10 分光镜选择原则:分光镜选择原则:根据所用激光 波长来选择合适的分光镜。 1 405 激光选择 Substrate;2其 他可见波长的激光根据其波长选择分 光镜, 如 488 激光可选择 DD488/552、 TD488/552/638 分光
12、镜。 3RT 15/85 分 光镜所有波长激光都可用,但是会损 失 85%的激光能量和 15%的荧光能量,一般在进行光谱扫描的时候选用。 Sequential Scan:若染料的发 射光谱有重叠,为减少串色,成像 时每种染料要单独激发,或者说, 每次只用一种激发光激发,并只检 测一种染料。可用 Sequential Scan 来实现。 (如右图)激活 Sequential Scan 功能, 可在下面的 Seq 中分别 设置各个染料的激发和检测光路。 2.4.2 选择扫描模式 默认模式为 xyz 扫描,是最常 用的扫描模式,可用于 xy 扫描和 z 轴层切(xyz 扫描) 。还可在下拉 菜单中选
13、择由 x,y,z,t (时间) 以及(波长)组合而成的多维扫 描模式, 如 xzy, xyt, xy, xyzt, xyz,xyzt 等。 2.4.3 设置扫描参数 包括分辨率(format) 、扫描速 度 (speed) 、 针孔大小 (pinhole) 、 线平均(line average) 、面平均 (frame average) 、累加 (accumulation) 及放大倍数 (Zoom) 等。 (如右图) 分辨率:默认值为 512512。也可选择更低或更高分辨率。分辨率越 高,所获取的图像文件越大,采图所需时间也越长。 扫描速度:默认值为 400Hz。活细胞或运动的样品成像可能需要
14、更快的 速度。可选择双向扫描(Bidirectional X)来达到更高速度,这时可能需要 进行相位校准(Phase correction) 。 针孔大小:默认值为 1AU。如果增大针孔直径,可增加信号强度,但是 所获取图像的共聚焦效果会降低,光切厚度也会随之增加。 平均:用于降低背景噪音。分为线平均(Line average)和面平均(Frame average) ,可在下拉菜单中选择平均的次数。 累加:仅用于荧光非常弱的样品 11 2.4.4 预览图像 点击软件 Acquire 界面左下方的“Live”按钮以预览图像(下图) ,图像 将显示在右侧的显示屏上。 预览开始后, “Live”按钮
15、变为“Stop” ,点击“Stop”按钮可停止预览。 注意:注意:一旦预览开始,激光开始照射样品,为减少对样品的伤害,应一旦预览开始,激光开始照射样品,为减少对样品的伤害,应 快速操作,尽量减少预览的时间。快速操作,尽量减少预览的时间。 建议: 点击 Live 按钮之前, 可调节 format 至 512512, speed 至 600Hz 以获得较快的刷新频率。 预览应达到以下目的:预览应达到以下目的: 1找到最适合观察的焦平面; 找到最适合观察的焦平面; 2使图像亮度动 使图像亮度动 态范围达到最佳态范围达到最佳。 可通过调节控制面板的 “Z Position” 旋钮找到最适合观察的焦平面 (如 下图) ;或者调节遥控手轮或显微镜镜体上的调焦旋钮(见第 8 页图) 。 图像亮度动态范围可通过调节激光输出功率(见第 9 页图) 、Smart Gain 和 Smart Offset(见上图) 。 参数的调整原则:参数的调整原则: (1) Smart Gain 的调节: 增大则信号和噪音都增强, 减小则信号和噪音均减小。 一般情况下,Gain 值的正常范围为 5001000; (2)Smart Offset 的调节:可扣