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1、植保研究技术,李向东 ,植物病理学部分,血清学技术 李向东 分子生物学 刘爱新 病毒学 李向东 细菌学 李向东 真菌学 刘爱新 论文写作 刘爱新,About me,SDAU 1986 CAU 1996-1999 SLU 2002.9-2003.7 SLU 2005.8-2005.9 NF 2008.11-2009.4,8242523 ,讲授课程： 本科生 普通植物病理学 植保研究技术 研究生 专业英语 分子植物病毒学 科研方向：植物病毒病害与抗病毒基因工程,教授，博导，植物病理学系主任, 山东植物病理学会秘书长, 泰安市青年联合会副主席 主持国家自然科学基金、教育部、科技部等课题 2002年
2、获得“山东省十大杰出青年”提名 2007年 入选教育部“新世纪优秀人才支持计划” 2009年 中国植物保护学会第三届青年科技奖,Shandong Agricultural University,血清学技术,一 抗原 二 抗体 三 抗血清制备 四 常用血清学方法 五 血清学应用举例,第一节 抗原,抗原（antigen, Ag）：能刺激动物产生抗体，并和抗体发生反应的生物大分子 免疫原性（Immunogenicity） 反应原性（Reactiongenecity） 完全抗原 （complete antigen） 半抗原 (hapten),抗原决定簇 antigenic determinants,决
3、定抗原性的特殊化学基团 蛋白质、糖蛋白、脂蛋白和多糖都是良好的抗原，双链核酸也有抗原性,抗原决定簇可由57个氨基酸、单糖或核苷酸残基组成,蛋白质的抗原性和与其分子量、氨基酸组成和分子形状有关,分子量10kd、酪氨酸含量高则抗原性好 球形分子的免疫原性比纤维形分子强 聚合状态的比单体的免疫原性高（病毒颗粒比蛋白亚基抗原性强）,特异性取决于氨基酸组成及其三维结构上的差异 所有残基共同决定特异性，但有些具有免疫优势（immunodominance） 抗原要高度纯化,分子局部构型对抗原性有影响,大多存在于抗原物质的表面，有些存在于抗原物质的内部，须经酶或其他方式处理后才暴露出来。,完全抗原 compl
4、ete antigen 半抗原 hapten 载体 carrier,植物保卫素:植物受到病原物侵染后或受到多种生理的、物理的刺激后所产生或积累的一类低分子量抗菌性次生代谢产物.,第二节 抗体,可结合A蛋白,IGg 分子结构,特异性示意图,交叉反应（cross reaction）,决定簇相同或相似 RRRRRRR PTKPTKA KITCDAG RRRRRRR PTKMTKA ILSHHCC,第三节 抗血清制备,1 常用的免疫动物,羊、马、鸡、猴、豚鼠、兔 选择动物应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。 免疫用动物应选适龄、健壮，最好
5、为雄性。,最常用的实验动物是家兔,一般选择选择年龄在6个月以上、当年繁殖的体重2 3公斤的雄性家兔,2 抗原稀释,用灭菌生理盐水将抗原稀释为12mg/ml，与佐剂混合制成乳剂后用于动物免疫。每次12ml。 免疫原的注射剂量应考虑其抗原性的强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。 首次免疫，抗原需要与等量的福氏完全佐剂混合。加强免疫的剂量为首次计量的1/2，通常用不完全福氏佐剂或不用佐剂。 如需制备高度特异性的抗血清，可选用低剂量抗原短程免疫法；反之，欲获得高效价的抗血清，宜采用大剂量抗原长程免疫法。,3 佐剂 adjuvant,佐剂是和抗原一同注射时，能增加抗原的免疫原性或改变免疫反应类型
6、的物质 动物对抗原刺激的特异性反应称为免疫应答（immune reaction） 佐剂 增强机体对抗原的免疫应答能力,常用弗氏佐剂（Freunds adjuvant） 完全弗氏佐剂 有卡介苗 不完全弗氏佐剂 无卡介苗 卡介苗（或过期死苗）,石腊油（或植物油） 羊毛脂（或Tween80）,夏天 6 4,冬天 3 7,水浴溶化、混匀，分装于青霉素小瓶，用纱布、线绳扎紧瓶塞。8磅20分钟灭菌，4保存备用。 免疫前准备抗原乳剂制备时，每毫升试剂中加入10mg活卡介苗，即为福氏完全佐剂。,佐剂的作用,形成抗原储存库 佐剂改变了抗原的物理性质，形成抗原储存库，使抗原缓慢释放到淋巴系统中，同时也扩大了抗原面
7、积 形成局部肉芽 肉芽或炎症，吞噬细胞活动增强 刺激淋巴细胞增殖和分化 扩大机体应答的能力,佐剂的用法,抗原佐剂1：1混合 涡旋混合 研钵中研磨 注射器吸进并强力挤出,液滴在水面上滚动，不散开,第一次用完全佐剂，第二次用不完全佐剂,（Water-in-oil emulsion）,3、免疫途径和免疫周期,免疫 抗原注射途径 皮内、皮下、肌肉、静脉或淋巴结内 一般常采用背部、足掌、淋巴结周围、耳后等处皮内或皮下多点注射 免疫周期 初次免疫与第二次免疫的间隔时间多为24周。 常规免疫方案为抗原加CFA皮下多点注射进行基础免疫；再以免疫原加IFA作25次加强免疫，每次间隔23周，皮下或腹腔注射加强免疫
8、。,试血与放血,试血 微量免疫法 琼脂免疫扩散法 （1：16以上） 放血 放血前动物应停食12 h，以减少血清中的脂肪含量。,心脏取血 9#针头 2.5kg, 20-30ml 耳缘静脉滴血 50ml 颈动脉放血 80100ml,血清的分离与保存,离心收集 凝固后离心 培养皿中37摄氏度1小时4度下过夜 器皿消毒,抗血清的保存,1）经鉴定合格后的抗血清，以1:100比例加入1%的硫柳汞或5%的叠氮钠，使其最后浓度分别为0.01%或0.05%。 2）用无菌滴管将抗血清分装小管，每管装1ml左右。 3）-20以下保存，可保存2年以上。 4）如有条件可将血清冷冻干燥保存于4以下，保存时间更久。,利用原
9、核表达的CP制备抗血清,TVBMV蛋白的高通量表达,Potyvirus 抗体的特异性（一周，一个月） 原核表达的抗体有时候与天然蛋白无反应,MAb的不足 1 制备时费时费力，成本相对高 2 专化性 太专化 3 灵敏性 对构像改变敏感 所以它不能取代PcAb的作用。,第四节 常用血清学方法,一 琼脂免疫双扩散 immuno-double diffusion,利用可溶性抗原与可溶性抗体在含有电解质的琼脂网状基质中向四周自由扩散，由近及远形成浓度梯度的原理而进行的。,当抗原和抗体在琼脂基质中适合比例下相遇，便可相互结合，形成肉眼可见的沉淀线，此种沉淀反应称为琼脂免疫扩散（简称琼扩）。,抗原抗体反应,
10、1称取一定量的琼脂粉，按1%的比例加入生理盐水，水浴煮沸融化20min。 2将融化的琼脂倒入平皿内(厚度2mm3mm)，自然冷却。 3根据要求按模板打孔。,4挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。 5在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。 6以毛细滴管吸取样品加入孔内，注意不要产生气泡，以加满为度。加少了，影响反应程度，加多了，易溢出，也影响反应结果。 7加毕后，盖上平皿盖，将平皿翻过来，置湿盘中，37自由扩散24h48h。,TMV TMV,TMV ToMV,TMV CMV,单向扩散试验 （single immunodiffusion）,对流电泳（counte
11、r immunoelectrophoresis）,二 酶联免疫吸附分析（ELISA） Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA是一种固相吸附和免疫酶技术相结合的方法。将抗原和抗体包被在固相支持物上，使免疫反应在固体表面进行，并借助结合在抗原或抗体上的酶与底物的反应所产生的有颜色的产物检测相应的抗体或抗原。,工作原理,酶联板表面具有吸附大分子的能力; 抗原和抗体具有特异性结合能力; 酶标抗抗体具有特异性识别抗体和酶催化作用; 在酶放大的作用下, 使不可见的分子识别反应变为可见的颜色变化； 抗原的数量 正比于 酶的数量即颜色的深浅。,底物,样品中有各种抗原,第
12、二抗体的生产,Mouse serum injected into a different species, e.g. rabbit, goat.,直接法和间接法,?,直接法,洗涤,洗涤,待测抗原,洗涤,洗涤,洗涤,待测抗体,酶标抗抗体,间接法,Wash, 封闭,双抗体夹心法 (indirect Sandwich),常用的酶,辣根过氧化物酶 碱性磷酸酯酶,波长：490nm 波长：405nm,底物：邻苯二胺 硝基酚磷酸,酶联板及显色效果,ELISA 检测结果,ELISA 读数仪,BIORAD 550 包含405nm, 450nm, 490nm 和655nm滤光片 程控，可使用96孔酶联板,ELIS
13、A 反应最常见的问题,假阳性 重复性不好 数值介于阴性和阳性之间 假阴性 难于查找原因,3 点免疫结合测定技术 (dot immunobinding assay, DIBA),ELISA的缺点是免疫反应物消耗量较大，抗体被酶联板吸附后与抗原结合力下降；抗原抗体相互作用比在液相中慢。 DIBA利用硝酸纤维素膜代替酶联板进行酶联免疫吸附测试，使检测更为简便、快速、经济，灵敏度高。结果也可长期保存),Tissue-blot,E：胚 ES: 胚囊 F:珠柄 M:珠孔 S:胚柄 T:种皮 V:,E：胚 EC胚乳胞质 ES: 胚囊 ESh胚鞘 F:珠柄 M:珠孔区 R:胚根 S:胚柄 T:种皮,4 Wes
14、tern blotting,Western Blot基本原理,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,Western Blot一般流程,蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳,转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色,五 血清学方法应用举例,1 病原鉴定 （株系，生理小种） 2 病原检测 3 基因功能 4 致病机理 5 ,1 病原鉴定 （株系，生理小种）,种专化的抗体 株系（生理小种）专化的抗体,2 病原检测,小麦丛矮病 灰飞虱带毒率 越冬寄主带毒率 种子带菌率 烟草植株带毒率 移栽前检测,Botrytis cinerea,conidio
15、phore,Effect of relative humidity on development of Botrytis infection in raspberries 相对湿度对Botrytis侵染的影响,Experiment compares the following: 1. Control = no fruit 2. Infected fruit kept in low humidity 3. Infected fruit kept in medium humidity 4. Infected fruit kept in high humidity,加抗原,7. 加底物,3. 加一抗,3 基因功能,表达产物的免疫定位 免疫胶体金技术,SPCSV,胶体金标记 mCP抗体,4 致病机理？,水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV ) 病害特异性蛋白SP (Disease-specific protein),方法选择？ ELISA 还是PCR？,
