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1、 鱼类急性毒性实验设计一 实验目的及意义 本实验通过观察在不同受试物浓度处理下，鱼的急性中毒表现和经过，了解和基本掌握测定毒物的半数致死剂量/浓度 （LD50/LC50）的方法，了解受试物剂量和生物反应的关系及计算表示方法。通过鱼类急性毒性试验可以评价受试物对水生生物可能产生的影响，以短期暴露效应表明受试物的毒害性。鱼类急性毒性试验不仅用于测定化学物质毒性强度、测定水体污染程度、检查废水处理的有效程度，也为制定水质标准、评价环境质量和管理废水排放提供环境依据。二 实验原理 鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，鱼类毒性试验在研究水污染及水环境质量中占重要地位。当水体中的污染物达到一定程度时，就会引起
2、一系列中毒反应，例如行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变、直至死亡。在规定的条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液，实验至少进行24h，最好以96h为一个实验周期，在24 h、48 h72h、96 h时记录实验鱼的死亡率，确定鱼类死亡50时的受试物浓度，半数致死浓度用24h LC50、48h LC50、72h LC50和96h LC50表示，并记录无死亡的最大浓度和导致鱼类全部死亡的最小实验浓度。 本实验将经过曝气驯化的鱼（保证其初始状态一致），放入不同浓度的重铬酸钾溶液中进行96hr的观察，记录不同浓度组6、24、48、72和96hr的鱼的死亡率，得出剂量-死亡率曲线，求出不同时间的LC5
3、0。三 实验材料1）待测化学物：使用实验室剂-重铬酸钾溶液K2Cr2O7（Cr6+, 2000mg/L）溶液、曝气自来水）以及助溶剂（丙酮）。2) 实验动物：斑马鱼（从鱼市购买）：用曝气后的自来水驯养3天，补充氧气以保证溶解氧的浓度。 3）实验常用仪器设备：温度控制仪 分光光度计 玻璃水槽 抄网（尼龙制，对照和实验容器分用） 气相色谱-质谱联用 pH计(PHS-3B) 溶解氧测定仪(JYD-1A) 水硬度计 温度计 电子分析天平 烧杯（25，50ml） 移液管（1，10ml） 量筒等。 四 实验步骤1、实验动物的选择。 鱼是水生生态系统的重要组成部分,是人类主要的食物来源,所以,鱼类的急性毒理
4、资料是常用的评价有毒化学物质和工业废水对水生生物危害的资料.实验鱼类一般选择对污染物敏感，在生态类群中具有代表性，经济价值比较高，来源丰富、取材方便、遗传稳定，生物学背景资料丰富，大小适中，在室内条件下易于饲养和繁殖的种类。而斑马鱼是国际标准化组织(ISO)推荐的实验鱼种，其个体较小，性成熟期短，繁殖能力强，价格便宜。被广泛的应用于生命科学的研究，也是实验室标准毒理学检验最常用的实验动物，所以本实验选用斑马鱼作为实验动物。2. 实验溶液的制备以重铬酸钾为实验毒物，实验溶液的母液由蒸馏水配制而成。母液最好每日配各1次，比较稳定的物质也可以两日配制1次，配好后， 最好低温保存。配制好的母液可以稀释
5、为进行毒性实验的溶液，以等比或等对数间距设置浓度系列，相临浓度比值不得超过2.2。 3、实验动物的喂养环境。(1) 实验用水 使用高质量的自然水或标准稀释水，也可以使用饮用水(必要时应除氯。水的总硬度为10-250mg/L (以CaCO3计)， pH为 6.0-8.5。 (2) 实验周期 96h。 (3) 实验负荷 静态实验系统最大承载量为1.0 g鱼/L。(4) 光照每天 12-16h.(5) 温度与实验鱼种相适宜，变化范围土2。 (6) 溶解氧不低于空气饱和值的60%。曝气时不能使受试物明显受损。 4、实验动物的染毒实验。1）预试验：般用 35 个动物, 实验在2L的烧杯中进行，用对数比例
6、形成的系列浓度, 如 0.01, 0.1, 1, 10, l00ppm, 同时做一对照（如受试物为废水, 采用体积百分比浓度, 如 0.01, 0.1, 1, 10, 100%)，以确定高锰酸钾对斑马鱼24h100%致死的最低浓度和96h不引起死亡的最高浓度。尽可能使LC50在设置的浓度范围内，每个浓度设平行。实验开始后每隔一段时间观察记录，整理24h、48h，72h，96h观察记录，需要统计各容器试验鱼的存活情况和行为特征，实验观察时发现死鱼需要及时捞出。实验数据记录。表一 ：浓度/(mg/l)014.55.07.010死亡率/%2）正式试验：试验结束时，对照组的死亡率不得超过10。从预实验
7、得到的无死亡浓度和100%死亡浓度之间，以实验配置好的母液以及稀释水，按照一定的间隔设置6个实验浓度组（4.5mg/L, 5.0mg/L, 5.5mg/L, 6.0mg/L, 6.5mg/L, 7.0mg/L）和一个空白对照组（曝气自来水）以及助溶剂（丙酮）对照组，每组设三个平行。每组10条斑马鱼，以96h为一个实验周期，采用静水流的方式，在24h，48h，72h，96h后分别观察斑马鱼存活状况，并记录溶解氧、pH、温度情况，鱼的死亡情况及行为变化等等（如鱼体侧翻、失去平衡，游泳能力和呼吸能力减弱，色素沉积等）。还要及时捞出死鱼。 最终确定鱼死50%时受试物的浓度，半数致死浓度用24h-LC5
8、0、48h-LC50、72h-LC50、96h-LC50来表示，判断斑马鱼死亡需要用玻璃棒轻轻按压斑马鱼的尾部，如果没有反应即认为斑马鱼已经死亡。 实验数据记录。 表二死亡率浓度（mg/L）24h48h72h96hX1x2x3平均值x1x2x3平均值x1x2X3平均值x1x2x3平均值自来水空白丙酮空白4.55.05.56.06.57.0 根据高锰酸钾对斑马鱼的致死数据计算出其平均死亡率，再转化为概率单位，求出概率单位与高锰酸钾浓度对数的回归方程，计算出高锰酸钾的LC50，数据记录在表3。 表3污染物实验时间/h相关系数LC50（mg/L）高锰酸钾24487296根据鱼类毒性分级标准，LC50
9、10000mg/L为微毒或无毒。再以此判断含该化合物的废水的毒性.，具体参见下表。关于含高锰酸钾的废水毒性实验,实验设计废水浓度100、50、40、20、10、5和0(CK)7个处理，3次重复。每组废水中均放入10尾斑马鱼,实验周期为96h,开始暴露前,试验鱼逐条测量全长和体重,各组之间试验鱼的全长和体重均无显著性差异.采用自然光照,对照组和实验组同时进行试验,试验期间每24h更换一次试液.为防止饵料影响,试验期间不喂食.每两小时观察记录1次斑马鱼的生活作息;分别于4h,8h,12h,24h,48h,96h时统计斑马鱼的死亡率.表4：废水浓度(%)不同实验时间鱼的死亡率(%)4h8h12h24
10、h48h96h0510204050100五 数据计算根据斑马鱼在各观察时间段的死亡率,计算出LC50, SC,MAC和Tua急性毒性特征参数。(1) 半致死浓度（LC50）：采用概率单位-质量浓度直线回归计算。(2) 安全浓度(SC):SC=0.1各观察时段的半致死浓度。(3) 毒性累积程度（MAC）:MAC=某观察时段的半致死浓度差值/最初观察点与实验结束时的半致死浓度差值100%。分析斑马鱼对含A废水的蓄积与降减动态。(4) 急性毒性单位(Tua)=100%/LC50 (5) 以暴露浓度为横坐标，死亡率为纵坐标，在计算机或对数概率纸上，绘制暴露浓度对死亡率的曲线。用直线内插法或常用统计程序
11、计算出 6 h、24 h、48 h、72 h、96 h的半致死浓度（LC50）值，并计算95的置信限。 (6) 如果实验数据不适于用标淮方法计算LC50，可用不引起死亡的最高浓度和引起100%死亡的最低死亡浓度估算LC50的近似值，即这两个浓度的几何平均值。六 实验结果分析附：标准稀释水的配制方法 1、制备标准稀释水前先按照下列要求配制4种溶液 (1) 氯化钙溶液 将11.76g CaC12 2H2O溶解于水中，稀释至1L。 (2) 硫酸镁溶液 将4.93g MgSO4 7H2O溶解于水中，稀释至1L。 (3) 碳酸氢钠溶液 将2. 59g NaHCO3溶解于水中，稀释至1L。 (4) 氯化钾溶液 将0.23g KCl溶解于水中，稀释至1L。 2、将这4种溶液各25mL加以混合并用蒸馏水稀释至1L，即配成标准稀释用水。 3、溶液中钙离子和镁离子的总和是2.5mmol/L。 Ca: Mg的比例为4: 1， Na : K 比为10:1。稀释用水需经曝气直到氧饱和为止，然后储存备用，在使用前不必再曝气。
