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1、第10章 微生物与基因工程,上海交通大学 农业与生物学院,是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或 合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内， 使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生 物表现出新的性状。,基因工程（genetic engineering）或 重组DNA技术(recombinant DNA technology),（参见 p265）,1. 基因分离：,a）分别提取供体DNA和载体DNA,2. 体外重组,b）用专一性很强的限制性核酸内切酶分别切割供体和载体DNA,在DNA连接酶的作用下使具有相同粘性末端的供体DNA片段和 载体连接，成为重组载体。,3. 重组载体
2、的传递与筛选,用人工转化的方法将重组载体导入受体细胞中，并通过一定 的筛选标记筛选得到含有目的外源片段的重组子.,4. 在特定的宿主中表达,得到基因工程产品,一、基因工程的基本过程,第一节 基因工程概述,（参见 p265）,二、基因工程的发展历史,对基因工程的建立与发展具有重要意义的几项关键技术：,DNA的特异切割,DNA的分子克隆（人工转化方法的建立）,DNA的快速测序,聚合酶链式反应（PCR）（DNA的指纹图谱） 亲子鉴定和罪犯鉴别,DNA合成技术,DNA的定位诱变技术,三、微生物学与基因工程的关系,1）基因工程所用克隆载体主要是用质粒、病毒、噬菌体改造而成；,2）基因工程所用工具酶绝大多
3、数是从微生物中分离纯化得到的；,3）将外源DNA导入宿主细胞的人工转化方法，是在微生物自然转 化现象的基础上发展起来的；,4）微生物细胞是基因克隆的重要宿主，,5）微生物是基因产物的重要表达载体；,6）基因工程得以建立与发展的理论基础主要来自对微生物 的研究；,7）微生物的多样性，为基因工程提供了极其丰富而独特的 基因资源；,微生物学不仅为基因工程提供了理论基础， 同时也提供了操作技术,（参见 p266）,第三节 微生物与克隆载体,以扩增外源DNA为目的载体-克隆载体（cloning vector）,作为克隆载体的基本：,（1）载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制,（2）载体应具有若干限制酶
4、的单一切割位点，便于外源DNA的插入,（3）载体必须具有可供选择的遗传标记,（4）载体DNA须易于生长和操作,（参见 p274）,基因工程的常用载体：,质粒载体,噬菌体载体,柯斯质粒载体,M13噬菌体载体,真核细胞的克隆载体,人工染色体,噬菌粒载体,一、质粒克隆载体,a）低分子量有利于DNA的分离和操作；,特点：,b）具有较高拷贝数；,c）易于导入细胞；,d）具有安全性；,质粒载体克隆外源DNA片段的大小一般不超过15Kb,二、噬菌体克隆载体,将野生型噬菌体DNA进行改造后建成，主要是去掉噬菌体 DNA上过多的常用限制酶的酶切位点，及对非必要基因区域 进行改造。,特点：,1）它的分子遗传学背景
5、十分清楚,2）噬菌体载体的容量较大。一般质粒载体只能容纳10多个kb。 而噬菌体载体却能容纳大约23kb的外源DNA片段。,3）具有较高的感染效率。其感染宿主细胞的效率几乎可达100， 而质粒DNA的转化率却只有0.1。,4）和质粒相比，噬菌体具有更为狭窄的寄主范围，因此更加安全,经过体外基因操作和包装后形成重组 噬菌体，可以通过正常的感染途径进 入宿主细胞； 重组噬菌体DNA也可不经过体外包装 而直接通过转染（转化）方式进入宿 主细胞；,质粒和噬菌体载体都可用于 构建基因文库； 但后者更有优势： 容纳的外源DNA片段较大； 以感染途径进入宿主细胞的 效率比转化高；,三、柯斯质粒载体,柯斯质粒
6、载体 （cosmid vector）， 又称粘粒，是由 噬菌体的粘性末端 和质粒构建而成。,Cosmid (cos site-carrying plasmid) 带有粘性末端位点( cos) 的质粒,特点：,1）具有噬菌体的特性：在克隆了外源片段后可在体外被包装成噬菌体颗粒，高效地感染对噬菌体敏感的大肠杆菌细胞。进 入寄主的柯斯质粒DNA分子，按照噬菌体DNA的方式环化， 但无法按噬菌体的方式生活，更无法形成子代噬菌体颗粒。,2）具有质粒载体的特性：在寄主细胞内如质粒一样进行复制，携带有抗性基因和克隆位点，并具氯霉素扩增效应。,3）具有高容量的克隆能力：柯斯质粒本身一般只有57kb左右， 而它
7、克隆外源DNA片段的极限值竟高达45kb，远远超过质粒载 体及噬菌体载体的克隆能力。同时，由于包装限制，柯斯质 粒载体的克隆能力还存在一个最低极限值。例如， 5 kb大小的 柯斯质粒载体，插入的外源片段至少不能小于30 kb。,柯斯质粒用于克隆大片段的DNA分子特别有效，而 这种特性对于研究高等生物的基因组十分重要。,四、M13噬菌体载体,M13是大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组为环状ssDNA， 大小为6407bp,2）进入细胞后，转变成复制型 (RF) dsDNA，然后以滚环方式复 制出ssDNA。每当复制出单位长度正链，即被切出和环化， 并被立即组装成子代噬菌体和以出芽方式（即宿主细胞不被
8、裂解）被释放至胞外。,1）通过性毛感染雄性（F+或Hfr）大肠杆菌,或通过转染进入雌性大肠杆菌细胞,生活史：,M13克隆载体是对野生型M13进 行改造后建成，其特点是虽然克 隆外源DNA的能力较小，一般只 适于克隆300400bp的外源DNA 片段，但特别适合用于制备克隆 基因的单链DNA。,主要被用于制备测序用单链DNA 模板、特异的单链DNA探针，进 行定位诱变等，也可用于噬菌体 展示（phage display）。,五、噬菌粒载体,丝状噬菌体和质粒载体DNA融合而成，兼有两者优点。,五、噬菌粒载体,六、真核生物的克隆载体,真核生物基因调控以及真核基因产物转录及翻译后的加工 等问题，单用原
9、核生物载体所很难解决,现在常用的真核生物载体，主要有以下二大类：,1）酵母质粒载体（穿梭载体）,2）真核生物病毒载体 3） 人工染色体（YAC）,（参见 p277）,第四节 微生物与基因工程工具酶,基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物 中分离和纯化而获得的,一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）,能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割 DNA的一类内切酶。简称为限制性酶（restrition enzyme）。,在细菌细胞内限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的 限制修饰系统，利用限制酶降解进入细胞内的外源DNA， 同时用甲基化酶修饰
10、细菌本身DNA，以避免被酶降解。,（参见 p280）,1. 命名与分类,取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母 加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后发现几个不 同的酶，则用罗马数字加以表示。,EcoRI,表示大肠杆菌属名第一个字母,E：,表示种名头两个字母,co：,表示株名,R：,表示该菌中第一个被分离出来的酶。,I：,根据限制酶识别和切割DNA的特点，可将限制酶分为 I、II、III三种类型,I型和III型限制酶无切割特异性或特异性不强,II型限制酶切割位点位于识别位点之内或在附近，特异性最强。,2. 限制性核酸内切酶的基本特性,识别序列通常由48个碱基对组成
11、，具有二重旋转对称轴， 序列呈回文结构（palindromic structure）。,所有限制酶切割DNA后，均产生含5磷酸基和3羟基的末端,Hind III的识别序列：,5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5,5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5,切割后形成具有粘性末端（cohesive end）的DNA片段：,限制性酶不在识别序列的对称轴上切割，而是交错切割 结果形成5 或3单链突出的粘性末端的DNA限制片段。,二个具有互相匹配的粘性末端的DNA片段可以通过碱基 的互补及DNA连接酶的作用而重新连接起来。,HpaI的识别序列：,5 - G
12、 T T A A C - 3 3 - C A A T T G - 5,5 - G T T A A C - 3 3 - C A A T T G - 5,切割后形成具有平末端（blunt end）的DNA片段：,限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段 没有突出的单链。,具有平末端的DNA片段也可以在DNA连接酶的 作用连接起来,不同的限制性核酸内切酶识别DNA中的碱基对序列长短 不同。在随机排列的DNA序列中，识别位点序列长的限 制酶，在酶切后所得到的DNA片段长，相反识别位点序 列短的限制酶，酶切后所得到DNA片段短。,3. 同裂酶（Isoschizomers）,有些来源不同的限制酶却
13、识别和切割相同的序列，这类限制酶 称为同裂酶。同裂酶产生同样切割，形成同样的末端，酶切后 所得到的DNA片段经连接后所形成重组序列，仍可能被原来的 限制酶所切割。同裂酶的反应条件可能存在差异。,4. 同尾酶 (Isocaudomers),有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生 出相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。但两种同尾酶切割 形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制 酶所识别和切割。,MunI：,5 - C A A T T G - 3 3 - G T T A A C - 5,EcoRI：,5 - G A A T T C - 3 3 - C T T A
14、 A G - 5,5 - C A A T T G - 3 3 - G T T A A C - 5,5 - G A A T T C - 3 3 - C T T A A G - 5,重新连接后的序列：,5 - C A A T T C - 3 3 - G T T A A G - 5,二、DNA连接酶（DNA ligase）,T4 DNA连接酶,大肠杆菌DNA连接酶,在体外将目的基因和载体共价连接构成 重组DNA分子,三、其它,DNA聚合酶：,从大肠杆菌中提取，用于体外合成DNA,碱性磷酸脂酶：,用于DNA连接时对载体的某段末端进行 修饰，以减少载体的自身环化,核酸外切酶：,用于DNA的缺失分析,单链
15、核酸内切酶：,用于修饰粘性末端及进行DNA结构分析,第五节 微生物作为克隆载体的宿主,一、宿主的基本要求与性质,能够高效吸收外源DNA；,具有使外源DNA进行高效复制的酶系统；,不具有限制修饰系统；,不具有DNA重组系统，常用重组缺陷型（RecA-）；,便于进行基因操作、筛选和大量繁殖；,具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。,二、常用的基因工程宿主,1）大肠杆菌,3）酿酒酵母,2）枯草芽孢杆菌,特点：生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中 生长，遗传学及分子生物学背景十分清楚,4）动物细胞,思考题,1）基因工程的基本步骤是怎样的？其中哪些需涉及 到微生物的参与？,2）为什么说微生物学不仅为基因工程提供了理论基 础，同时也提供了操作技术？,
