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1、第九章 吸光光度法,9.1 吸光光度法的特点 9.2 吸光光度法的原理 9.3 显色反应和显色条件的选择 9.4 测量条件的选择 9.5 目视比色法和光度计的基本部件 9.6* 吸光光度法的应用,1了解吸光光度法的特点； 2理解并掌握吸光光度法的原理，掌握朗伯比尔定律的 数学表达式及其意义并能进行有关计算； 3了解显色反应的要求，掌握显色反应条件的选择； 4掌握测量条件的选择； 5了解吸光光度分析方法和分光光度计基本原理和结构。,学习目标,9.1 吸光广度法的特点,分光光度法 是基于物质分子对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。按物质吸收光的波长不同，可分为可见分光光度法、紫外分光光度法及红外
2、分光光度法。 特点： *灵敏度较高（10-510-6molL-1），适用于微量组分的测定。但相对误差较大（25%）。 *具有操作方便、仪器设备简单、灵敏度和选择性较好等优点，为常规的仪器分析方法。,化学分析与仪器分析方法比较,光度法 ： 结果0.048%0.052%, 满足要求,容量法： V(K2Cr2O7)0.02mL, 测不准,重量法： m(Fe2O3)0.14mg, 称不准,例: 含Fe约0.05%的样品, 称0.2g, 则 m(Fe)0.1mg,光度分析：微量组分(10-310-6), 相对误差1%5% 依据物理或物理化学性质, 需要特殊的仪器,化学分析：常量组分(1%),相对误差 0
3、.1%0.2% 依据化学反应, 使用玻璃仪器,准确度高,灵敏度高,9.2 吸光光度法的基本原理,光是一种电磁波。所有电磁波都具有波粒二象性。光的波长、频率与光速c的关系为： （9-1） 光速在真空中等于2.9979108ms-1。 光子的能量与波长的关系为： （9-2） 式中E为光子的能量；v为频率；h为普朗克常数，为6.62610-34JS。,一、物质的颜色及对光的选择性吸收,10nm200nm,200nm 380nm,380nm 780nm,780 nm 2.5 m,2.5 m 50 m,50 m 300 m,光学光谱区,二、 物质的颜色与光的关系,单色光:只具有一种波长的光。 混合光:
4、由两种以上波长组成的光。 白光: 是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成的。 物质的颜色:是由于物质对不同波长的光具有选择性的吸收作用而产生的。例如：硫酸铜溶液因吸收白光中的黄色光而呈蓝色；高锰酸钾溶液因吸白光中的绿色光而呈紫色。因此，物质呈现的颜色和吸收的光颜色之间是互补关系。,如果把两种适当颜色的光按一定的强度比例混合也可以得白光，这两种光就叫互补色光。 如果吸收光在可见区,吸收光的颜色与透过光的颜色为互补关系,物质呈现透过光的颜色。 如果吸收光在紫外区，则物质不呈现颜色,光的互补性与物质的颜色,吸收光谱或吸收曲线,测定某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长为横坐标
5、，吸光度为纵坐标作图。 KMnO4溶液对波长525nm附近的绿色光吸收最强，而对紫色光吸收最弱。光吸收程度最大处的叫做最大吸收波长，用max表示。不同浓度的KMnO4溶液所得的吸收曲线都相似，其最大吸收波长不变，只是相应的吸光度大小不同。,苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱,三、光的吸收定律朗伯-比尔定律,(9-3),1.朗伯定律A=lg(I0/I)=kb,2.比尔定律 A=lg(I0/I)=k”c,吸光度与光程的关系 A = bc,吸光度与浓度的关系 A = bc,T透光率（透射比）,吸光度与透光率的关系: A = lg (I0/I) = lg(1/T) = -lgT = kbc,例9-1 浓度为
6、25.0 g/50mL的Cu2+溶液，用双环已酮草酰二腙分光光度法测定，于波长600nm处，用2.0cm比色皿测得T=50.1%，求吸光系数a和摩尔吸光系数。已知M(Cu)=64.0。,解 已知T=0.501，则A=lgT=0.300，b=2.0cm, 则根据朗伯比尔定律 A=abc， 而= Ma = 64.0gmol-13.00102 Lg-1cm-1 =1.92104(Lmol-1cm-1),例9-2 某有色溶液，当用1cm比色皿时，其透光度为T，若改用2cm比色皿，则透光度应为多少？ 解: 由A=-lgT=abc可得 T=10-abc 当b1=1cm时，T1=10-ac=T 当b2=2c
7、m时，T2=10-2ac=T2,定量分析时，通常液层厚度是相同的，按照比尔定律，浓度与吸光度之间的关系应该是一条通过直角坐标原点的直线。但在实际工作中，往往会偏离线性而发生弯曲，见图9-4中的虚线。若在弯曲部分进行定量，将产生较大的测定误差。,四、偏离朗伯一比尔定律的原因,图9-4 对比尔定律的偏离情况,朗伯一比尔定律只对一定波长的单色光才能成立，但在实际工作中，即使质量较好的分光光度计所得的入射光，仍然具有一定波长范围的波带宽度。在这种情况下，吸光度与浓度并不完全成直线关系，因而导致了对朗伯一比尔定律的偏离。所得入射光的波长范围越窄，即“单色光”越纯，则偏离越小。,单色光不纯所引起的偏离,由
8、于溶液本身的原因所引起的偏离,朗伯比尔定律是建立在均匀、非散射的溶液这个基础上的。如果介质不均匀，呈胶体、乳浊、悬浮状态，则入射光除了被吸收外，还会有反射、散射的损失，因而实际测得的吸光度增大，导致对朗伯比尔定律的偏离。,溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化也会引起偏离。其中有色化合物的离解是偏离朗伯比尔定律的主要化学因素。例如，显色剂KSCN与Fe3+形成红色配合物Fe(SCN)3，存在下列平衡：Fe(SCN)3 Fe3+3SCN 溶液稀释时，上述平衡向右，离解度增大。所以当溶液体积增大一倍时，Fe(SCN)3的浓度不止降低一半，故吸光度降低一半以上，导致偏离朗伯比尔定律。,一、显色反应要求
9、 这种被测元素在某种试剂的作用下，转变成有色化合物的反应叫显色反应，所加入试剂称为显色剂。 常见的显色反应大多数是生成配合物的反应，少数是氧化还原反应和增加吸光能力的生化反应。,显色剂,9.3 显色反应和显色条件的选择,显色反应的要求：,选择性好 所用的显色剂仅与被测组分显色而与其它共存组分不显色，或其它组分干扰少。 灵敏度要足够高 有色化合物有大的摩尔吸光系数，一般应有104105数量级。 有色配合物的组成要恒定 显色剂与被测物质的反应要定量进行，生成有色配合物的组成要恒定。,生成的有色配合物稳定性好 即要求配合物有较大的稳定常数，有色配合物不易受外界环境条件的影响，亦不受溶液中其它化学因素
10、的影响。有较好的重现性，结果才准确。 色差大 有色配合物与显色剂之间的颜色差别要大，这样试剂空白小，显色时颜色变化才明显。,二、显色反应条件的选择,显色剂的用量 显色反应一般可表示为 M+R MR,图 9-5 吸光度和显色剂用量曲线,溶液的酸度 许多显色剂都是有机弱酸或有机弱碱，溶液的酸度会直接影响显色剂的解离程度。对某些能形成逐级配合物的显色反应，产物的组成会随介质酸度的改变而改变，从而影响溶液的颜色。另外，某些金属离子会随着溶液酸度的降低而发生水解，甚至产生沉淀，使稳定性较低的有色配合物的解离。,显色温度 有些反应需要加热。有些显色剂或有色配合物在较高温度下易分解褪色。此外温度对光的吸收及
11、颜色深浅也有影响，要求标准溶液和被测溶液在测定过程中温度一致。 显色时间 显色反应有快慢，有的有色配合物容易褪色，因此不同的显色反应需放置不同的时间，并在一定的时间范围内进行比色测定。,副反应的影响 例如，被测金属离子M与显色剂R反应，生成有色配合物MRn，此时，若M有配位效应，R有酸效应，影响M配位反应的完全程度。通常，当金属离子有99%以上被配位时，就可认为反应基本上是完全的。 共存离子的影响 吸光度增加，造成正干扰。被测组分或显色剂的浓度降低，引起负干扰。,入射光波长的选择 以最大吸收波长max为测量的入射光波长。在此波长处，摩尔吸光系数最大，测定的灵敏度最高。 若干扰物在max处也有吸
12、收，在干扰最小的条件下选择吸光度最大的波长。有时为了消除其它离子的干扰，也常常加入掩蔽剂。,9.4 测量条件的选择,吸光度读数范围的选择 透光度读数误差T是一个常数，但在不同的读数范围内所引起的浓度的相对误差却是不同的。因此，为了减小浓度的相对误差，提高测量的准确度，一般应控制被测液的吸光度A在0.20.7（透光度为65%20%）。当溶液的吸光度不在此范围时，可以通过改变称样量、稀释溶液以及选择不同厚度的比色皿来控制吸光度。,参比溶液的选择 原则:使试液的吸光度能真正反映待测物的浓度。 利用空白试验来消除因溶剂或器皿对入射光反射和吸收带来的误差。 纯溶剂空白 当试液、试剂、显色剂均为无色时，用
13、纯溶剂（或蒸馏水）作参比溶液。 试剂空白 试液无色，而试剂或显色剂有色时，加入相同量的显色剂和试剂,作为参比溶液。 试液空白 试剂和显色剂均无色，试液中其它离子有色时，用不加显色剂的溶液作为参比溶液。,1.目视比色法,9.5 目视比色法和光度计的基本部件,方便、灵敏，准确度差。常用于限界分析。,2. 光电比色法,通过滤光片得一窄范围的光(几十nm),3. 吸光光度法和分光光度计,通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光. 波长可调, 故选择性好, 准确度高.,二.分光光度计的主要部件,1.光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,稳定。 可见光区：钨灯，碘钨灯(3202500nm) 紫外区
14、：氢灯，氘灯(180375nm) 2.单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。 棱镜: 玻璃3503200nm, 石英1854000nm 光栅: 波长范围宽, 色散均匀,分辨性能好, 使用方便,3.吸收池：(比色皿)用于盛待测及参比溶液。 可见光区：光学玻璃池 紫外区：石英池 4.检测器：利用光电效应，将光能转换成 电流讯号。 光电池，光电管，光电倍增管 5.显示器： 低档仪器：刻度显示 中高档仪器：数字显示，自动扫描记录,单色器介绍,A.棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同,B.光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。,原理：
15、 利用光通过光栅时 发生衍射和干涉现象而分光.,检测器介绍,A.硒光电池,B.光电管,红敏管 625-1000 nm 蓝敏管 200-625 nm,C.光电倍增管,160-700 nm,1个光电子可产生106107个电子,分光光度计的主要类型,单光束型,双光束型,光电二极管阵列型（DAD),标准曲线法 其方法是先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。以A为纵坐标，浓度c为横坐标，绘制A-c曲线，若符合朗伯比尔定律，则得到一条通过原点的直线，称为标准曲线。然后用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含
16、量，这就是标准曲线法。 在仪器、方法和条件都固定的情况下，标准曲线可以多次使用而不必重新制作，因而标准曲线法适用于大量的经常性的工作。,二、分光光度测定的方法,Blank Standard Sample Sample,标准对照法(直接比较法) 将试样溶液和一个标准溶液在相同条件进行显色、定容，分别测出它们的吸光度，按下式计算被测溶液的浓度。 k标=k测 b标=b测 所以 要求A与c线性关系良好，被测样品溶液与标准溶液浓度接近，以减少测定误差。用一份标准溶液即可计算出被测溶液的含量或浓度，方便，操作简单。,3吸光系数法 在没有标准品可供比较测定的条件下，按文献规定条件测定被测物的吸光度，从样品的配制浓度、测定的吸光度
