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1、烟曲霉菌感染的实验室检查方法周艳(综述)烟曲霉菌为空气中常见的腐生菌，为一种机会致病真菌，其孢子直径很小，可被动吸入呼吸道，在一般的环境下，人们每天都能吸入上百个烟曲霉菌孢子，但是通常情况下都不致病。近20年来随着广谱抗生素的滥用、肿瘤放疗和化疗，造血干细胞移植术、实体器官移植术后应用免疫抑制剂及糖皮质激素等药物以及肠外营养人数的增加以及艾滋病的流行等免疫抑制人群逐年增长1，临床上越来越多的免疫力低下的人群感染烟曲霉菌导致侵袭性肺曲霉病（invasive pulmonary aspergillosis, IPA）。侵袭性曲霉菌感染的发病率日益增长，其发病率已经超过了最常见的真菌感染侵袭性念珠菌
2、病。免疫力低下的老年病人发生侵袭性曲霉菌感染后的死亡率也一直居高不下。IPA以肺部感染为主，主要为急性坏死性出血性肺炎，并可波及骨骼、脑、肝、肾、心脏等全身多个重要器官，其预后极差，死亡率高达80902。由于IPA的发病机制尚未阐明，从而导致IPA的诊断极为困难，治疗成功率很低。为此，发展有效的烟曲霉菌感染实验室检查方法对于该病的诊断与治愈显得尤为重要，目前常见的实验室检测方法有：显微镜检查、病原生物学培养方法、血清免疫学检测法、分子生物学检测法等。本文就这些方法的研究作一综述。关键词：烟曲霉菌；聚合酶链反应；血清学诊断1、 显微镜检查 显微镜检查主要包括直接显微镜检查和组织病理学检查，都是以
3、形态学特点为基础来对病原微生物进行诊断。曲霉菌直接镜检呈现玻璃样透明的菌丝，但是其菌丝结构特点的特异性并不突出，其他种类相似的真菌如青霉菌亦可呈现类似的镜下特点。另一方面，组织病理学检查虽也是侵袭性曲霉菌感染确诊的“金标准”，病理表现为真菌菌丝侵入和定植于组织或者血管造成炎症改变。但是其报告总中经常会出现曲霉样形态学特点等描述性的诊断结果，这对在镜下类似曲霉菌类的其他病原微生物的鉴别诊断带来一定的困难，误诊的出现几乎不可避免。若是发生误诊的两种病原微生物的治疗方案相差较大，就会严重影响治疗效果，从而进一步导致预后不良。此外，检查者的主观因素也有可能对诊断结论产生影响。2、 病原微生物的培养病原
4、微生物的培养是诊断细菌与真菌感染的常规方法，特异性高，同时还可以用于细菌与真菌感染的药敏试验，为临床合理使用抗生素提供可靠的依据。标本病原微生物的培养结果是侵袭性曲霉菌感染确诊的“金标准”，这是曲霉菌感染的诊断基础3。烟曲霉菌培养是通过取病人血液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液（BAL）、尿液及感染病理组织等标本，接种于真菌培养基培养，其中血液、BAL及感染组织为常用的取材标本。各实验室采用的培养基及培养温度时间各有不同，如蔡氏培养基适用26培养3-4天，沙保培养基适用35培养1-2天，但因为培养时间长且敏感性不高，因而可能延误病人的诊断和治疗。与白色念珠菌、新型隐球菌等单细胞真菌比较，烟曲霉菌为丝
5、状型真菌，组织的机械破碎对丝状真菌成活力及培养有很大影响4。此外，由于曲霉菌是机会致病菌，从有菌区获取的阳性培养结果并不能明确是由于定植的正常菌群或是侵袭性感染所致。3、血清免疫学检测法 血清免疫学检测法是一种诊断病原因子感染的经典方法，原理是根据抗原抗体反应特异性的免疫学原理，检查患者血清、脑脊液、BAL、尿液等体液标本中病原因子特异的抗原或抗体。在烟曲霉菌感染血清学检测法的研究报道中，众多实验室研究的检测法都是围绕半乳甘露聚糖（GM）抗原而展开的。有研究5结果提示：采用酶免疫测定法（EIA）检测BAL标本中烟曲霉GM抗原有利于早期诊断并且指导治疗；阈值的设立对于EIA法的检测结果敏感性和特
6、异性会有影响。从49名确诊为侵袭性肺曲霉病（IPA）的个体和50名疑为IPA的个体采集的BAL标本，进行GM EIA的检测，当阈值设为1.0时，敏感性为61%；检测阈值为0.5时，敏感性为76%；相应的特异性分别为98%和94%。另外，从22名BAL标本烟曲霉培养阴性病人获取标本做GM EIA测定，当检测阈值为1.0时，敏感性为41%；检测阈值为0.5时，敏感性为59%6。还有实验室采用实验诱导建立兔IPA模型，然后用GM EIA方法检测分析。当最佳阈值为0.75时，未处理对照组的敏感性和特异性都达到100%；而抗真菌治疗组敏感性下降到92%7。另外，该实验存在一定的假阳性，也无法区别定植还是
7、感染。还有实验室发展了一种基于检测抗-Afmp1p抗原的抗体的酶联免疫吸附测定（ELISA）法用于检测烟曲霉感染。这种Afmp1p抗原是一种纯化重组的烟曲霉细胞壁抗原GM蛋白。目前这种基于检测抗-Afmp1p抗原的抗体的ELISA法的敏感性和特异性都比以前报导的基于检测其他抗原的ELISA法高8-9。此外，有实验室发展生物芯片技术检测GM效力用于评估前瞻性调查研究807例病人的3327例血清，特异性为99.6%，但对证明是或可能是曲霉病病人人群，敏感性却只有50%，可能是本实验出现的少量的假阳性病例限制了实验的敏感性10。其中引起假阳性的主要因素: (1)定植的曲霉释放的GM进入到血液循环系统
8、；(2) 与其他许多真菌抗原出现交叉反应；(3) 使用环磷酰胺的潜在影响；(4) 交叉感染；(4) cut-off 值的影响等等。血清免疫学检测实验方法及检测目标的多样化，加快了烟曲霉感染诊断的步伐，检测阈值也急需各实验室之间规范化。除了上述几个实验室涉及的血清学诊断检测目标及检测实验方法，还有其他的检测目标如：galf抗原、BG11等等。4、分子生物学诊断聚合酶链反应（PCR）分子生物学技术是一种新型的烟曲霉感染诊断方法，诊断的灵敏性高，越来越被人们所关注。目前成了国内外研究的热点，其技术的关键部分有聚合酶链反应( PCR) 扩增、DNA 分子探针、限制性酶切片段长度多态性分析( RFLP)
9、 、随机扩增DNA 多态性(RAPD) 等方法，其中PCR法具有特异性强、重复性好、全封闭反应、灵敏、快速等优点，因此，欧洲和美国FDA 推荐其用来诊断IPA，也被称为目前最理想的分子生物学方法。PCR诊断的检测标本有血清、脑脊液、BAL、尿液等，检测靶基因各实验室各有不同，检测方法也在不断改进，由开始的普通PCR、半定量PCR、定量PCR到实时PCR到定量实时PCR、巢式PCR等等12。PCR检测体系的靶基因主要包括烟曲霉菌一些基因位点的保守序列或是线粒体 DNA 片段。首先将标本中可能存在的烟曲霉菌DNA 提取出来，利用实时荧光定量 PCR 将其扩增得出初始标本中的曲霉菌 DNA 拷贝数或
10、是利用传统PCR将其扩增后，利用其他分析方法对扩增后产物进行分析，从而得到初始标本中的曲霉菌的量和种类等相关信息。PCR诊断技术类似于烟曲霉DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。有实验研究表明：从49名已证明为侵袭性肺曲霉病（IPA）病人和50名可能为IPA病人获取BAL标本，靶基因为烟曲霉真菌219 bp片段长度18s rRNA基因，采用定量PCR检测方法检测的敏感性和特异性分别为67%和100%。另外，从22名BAL标本烟曲霉培养阴性病人获取标本做定量PCR检测，敏感性为36% 13 。还有实验室采用实验诱导建立兔IPA模型，然后用定量实时PCR方法进行分析，
11、未处理对照组敏感性和特异性分别为80%和100%，而抗真菌治疗组的敏感性降低到50%14。M. Hummel和 B. Spiess等采用一种巢式PCR方法测定病人脑脊液曲霉DNA，靶基因为烟曲霉真菌138 bp片段长度18s rRNA基因，敏感性和特异性很高。他们尝试用巢式PCR检测曲霉病病人的脑脊液标本来确定是否有曲霉DNA，这种方法曾经在临床和实验上检测血液和BAL很有效。虽然脑脊液曲霉病诊断很困难，让人振奋的是使用巢式PCR检测6个脑脊液曲霉病病人标本都为阳性，敏感性100%15。Cathal E. OSullivan和 Miki Kasai等发展了一种基于荧光共振能量转移技术（FRET
12、）的烟曲霉特异性定量实时PCR法，检测标本为实验兔IPA模型BAL和肺组织，靶基因为5.8s区域基因。FRET定量实时PCR法检测烟曲霉DNA有很高的敏感性和特异性，在不久的将来将用人类标本进一步评估测定该方法16。Catriona Halliday和 Qi Xuan Wu等发展了一种巢式定性实时PCR方法用于探测临床标本中曲霉物种的DNA，这种检验方法比实时PCR法敏感性高，并且应用了低循环控制PCR系统，从而又进一步节省了检测时间17。Cornelia Lass-Florl Eberhard Gunsilius和Jason P. Trama等研究表明：抗真菌治疗开始后，全血标本用于做PCR
13、诊断的优点被限制，敏感性降低18，19，因此，组织标本被推荐做曲霉PCR检测。Cornelia Lass-Florl和Eberhard Gunsilius等实验室检测靶基因是一个高度保守序列多拷贝18s rRNA。抗真菌治疗后，病人血标本用来证明病人感染曲霉的PCR敏感性阈值只需40%，而肺组织仍需100%19。Kaisu Rantakokko-Jalava和 Sanna Laaksonen等发展了一种探测BAL和组织病理标本中烟曲霉线粒体DNA的实时PCR方法。伴随定性检测，该方法诊断敏感性为73%，特异性为93%，阳性预测值为73%，阴性预测值为95%20。除了上面简单介绍的几种PCR方法
14、，还有自动化重复序列PCR（rep-PCR）21,酶免疫测定PCR22，快速高通量多路径实时PCR23等等.各实验室采用各种改良PCR技术，通过获取临床病例或者实验动物模型，分析不同检测标本如血清、脑脊液、BAL、尿液等等，检测各个靶基因，检测阈值不同，检测敏感性和特异性也各有不同。值得注意的是，由于PCR易受呼吸道曲霉定植和空气中存在的曲霉孢子的污染、不能判断是活菌还是死菌、某些抗凝血药、DNA 释放的非连续性以及实验室存在的实验误差，这些问题往往限制了PCR方法在IPA 诊断中的使用24。总之，PCR诊断技术是一项快速、敏感、特异性好的诊断技术，对烟曲霉感染的辅助诊断很有意义。但是因为各实
15、验室采用的检测方法不一，检测标本来源及靶基因也各有不同，以及采集标本来自抗真菌治疗病人等等影响了烟曲霉感染PCR诊断的重现性和可靠性。为此，我们迫切需要烟曲霉感染PCR诊断技术的实验规范化。PCR法的检测结果与真菌感染之间的关系、临床诊断价值以及指导临床抗真菌治疗作用方面，有待进一步研究。5、其他的诊断方法 除了上述四种烟曲霉感染诊断的常用方法，还有其他的一些诊断方法用于烟曲霉感染的诊断，如：活检组织菌丝显影法，扩增片段长度多态现象分析法（AFLP25，BG试验法3等。伴随烟曲霉感染诊断技术的不断改良，快速、敏感、特异地诊断烟曲霉感染越来越被人们所关注。各实验室在改良实验技术的同时，通过各种实
16、验技术的结合用于烟曲霉感染的诊断，互补各实验技术的优缺点。如：Andrea Francesconi和 Miki Kasai等研究表明应用GM EIA和定量实时PCR合并诊断BAL标本中烟曲霉菌特异性抗原和DNA能提高检测的敏感性和特异性，减少诊断时间，从而早期正确使用抗真菌药物，改善烟曲霉菌感染，并且可以防止诊断阴性结果病人的滥用抗真菌药物7。Birgit Spiess和Dieter Buchheidt等建立了一种低循环控制实时PCR，其测定方法快速、敏感、特异，能定量化检测高危病人BAL标本和血标本中烟曲霉DNA。这是一种结合了实时PCR和低循环控制PCR的新型检测方法。实时PCR的敏感性比低循环控制PCR好，但后者用于检测真菌荷载比前者好，两种PCR方法相结合而成的低循环控制实时PCR法值得我们关注6。Catriona Halliday和 Qi Xuan Wu等结合实时PCR和巢式PCR并应用
