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1、毛细管气相色谱法测定食品中的环己基氨基磺酸钠宋家玉 焦艳妮 陈金东 周景洋 张宁 刘春娇（山东省疾病控制中心，济南，250014， 邮箱 ）摘要：建立了食品中环己基氨基磺酸钠的毛细管气相色谱检测方法。食品中的甜蜜素用水超声提取，酸性环境衍生化生成环己醇亚硝酸酯，庚烷萃取，分流不分流方式进样，用弱极性毛细柱程序升温分离，氢火焰离子化检测器检测，保留时间定性，外标法定量。甜蜜素浓度在 0.011.0mg/mL 范围内与峰面积线性相关，相关系数 r=0.9996，质量检出限为 1ng。 1.0 g/kg、 0.2g/kg和 0.05 g/kg三水平添加量的回收率为84.7%103.4%，测定结果相对
2、标准偏差为 2.95%6.79%（n=5） 。本方法经方法学考察具科学性和可操作性。关键词：环己基氨基磺酸钠食品 毛细管气相色谱法环己基氨基磺酸钠 (甜蜜素)是一种人工合成的非营养型食品甜味剂 （1） ，甜度约为蔗糖的 30-50倍。在我国广泛用于蜜饯、饮料等食品中，如超量使用，会引起食品安全问题。因此，我国对食品中的甜蜜素添加有严格的限量标准 （2，3） 。我国食品中环己基氨基磺酸钠的测定方法为 1991年首次发布 （4） ，2003 年标准 GB/T 5009.97仅对标准的名称和标准的结构编写进行了修改 （5） ，距今已有多年，在诸多方面不能适应现代食品安全的需要；为了保障消费者身体健康
3、，建立灵敏度高、特异性好而又简便易行的分析方法是很有必要的；近年来，甜蜜素检测技术研究取得了重要进展 （6-14） ，如毛细管气相色谱法、高效液相色谱法、离子色谱法、GC-MS 法、LC-MS 法等提高了甜蜜素的分析测试水平；修订原标准、提高方法的灵敏度、重现性、结果的准确性，不断增强标准的科学性和可操作性是该标准修订的主要目的和原则。为此我编制组接受卫生部食品安全综合协调与卫生监督局和食品安全国家标准审评委员会的委托，广泛征求意见，2010 年 10月底完成标准、文献资料收集整理工作，参照文献 （6-14） 确定标准研究的方法与技术路线；建立了修订标准第一法气相色谱法-毛细管气相色谱法和增加
4、第二法液相色谱法替代回收率、灵敏度、重现性均低的薄层法、比色法、填充柱气相色谱法；并对样品处理和仪器使用条件进行优化，开展方法重现性、灵敏度、检出限、分离度、准确度、线形关系等技术内容确定研究。用此方法对 2010年 10月至 12月间部分食品进行了环己基氨基磺酸钠分析验证。2011 年 5月中旬完成标准方法征求意见稿，现将建立的修订标准第一法气相色谱法-毛细管气相色谱法介绍如下：1实验部分1.1 主要仪器、试剂和材料1.1.1主要仪器气相色谱仪：CP-3800型包括氢火焰离子化检测器、STAR V6.2工作站，美国VARIAN公司；超声波清洗仪：AS3120A型，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；
5、高速均质器：IKA-T 18BS,德国IKA公司；离心机：转速4000 r/min。上海医疗器械手术离心机厂。1.1.2 试剂和材料正庚烷经重蒸、气相色谱确认符合检测的要求；氢氧化钠、亚铁氰化钾（K 4Fe(CN)63H2O） 、硫酸锌（ZnSO 47H2O） 、亚硝酸钠、浓硫酸、无水硫酸钠和氯化钠均为分析纯。石油醚：沸程为30-60。环己基氨基磺酸钠标准品：含量99%，美国SUPELCO公司产品 。水为GB/T6682规定的二级水。实验样品：系 2010年本实验室采集的部分食品 30 份。1.1.3 试剂配制氢氧化钠溶液（40g/L）：称取 20 g氢氧化钠，溶于水并稀释至 500 mL。硫
6、酸溶液（200g/L）：称取 100 g硫酸小心加入 400 mL水中，后加水至 500 mL。亚铁氰化钾溶液（150g/L）：称取 15g亚铁氰化钾，溶于水并稀释至 100 mL。硫酸锌溶液（300 g/L）：称取 30 g硫酸锌，溶于水并稀释至 100 mL。 亚硝酸钠溶液（50g/L）：称取 25 g亚硝酸钠，溶于水并稀释至 500 mL。 1.1.4 环己基氨基磺酸钠标准溶液配制环己基氨基磺酸钠标准储备液（5.00mg/mL）：精确称取环己基氨基磺酸钠标准品，用水溶解并定容至浓度为 5.00mg/mL ，置于 1-4冰箱保存，可保存两个月。环己基氨基磺酸钠标准使用液（0.50mg/mL
7、）：用水将 10.0 mL环己基氨基磺酸钠标准储备液稀释定容至 100mL；临用时配制。1.2实验方法1.2.1试样制备1.2.1.1液体试样处理一般液体试样摇匀后可直接取样。含二氧化碳的试样：称取 50.0g试样于烧杯中，放置电热板上加热以除二氧化碳，待除尽后，放冷，用水补足至 50.0g制成试样备用。含酒精的试样：称取 50.0g试样于烧杯中，用氢氧化钠溶液调至碱性，放置电热板上加热以除酒精，待除尽后，放冷，用水补足至 50.0g制成试样备用。1.2.1.2固体、半固体试样处理凉果、蜜饯类等固体试样先将其去核，坚果和籽类等先将其去壳，固体样品置于粉碎机打碎、均质，将粉碎好的样品放入食品保鲜
8、袋中，待取样用。冰棒、雪糕、冰淇淋等分别放置于 250 mL烧杯中，待融化后搅匀可直接称取。固体、半固体试样根据基质的不同按下列步骤进行处理：A 低脂、低蛋白样品（果酱、果肉、山楂饼、蜜饯、凉果、浓缩的果汁、果粒汁、甜点、酱菜、咸菜等）称取 5.00g-10.00g样品于 50 mL离心管中， 加 40 mL水 ，振摇，超声提取 20 min ，混匀，离心（2000 r/min ）10 min，过滤，用水分次洗涤残渣，收集滤液并定容至 100 mL，混匀备用。B 高蛋白样品（酸乳、果冻、雪糕、冰激凌等奶制品及豆制品、腐乳等）称取 5.00g-10.00 g样品于 50mL离心管中， 加 40
9、mL水 ，超声提取 20 min ，加 3 mL亚铁氰化钾溶液，混匀，再加入 3 mL硫酸锌溶液，混匀,离心（2000 r/min）10 min，过滤，用水分次洗涤残渣，收集滤液并定容至 100 mL，混匀备用。C 高脂样品（奶油制品、坚果和籽类等）称取 5.00g-10.00 g样品于 50 mL离心管中，加入 25 mL石油醚，振摇，超声提取 3 min ，再混匀，离心（1000 r/ min 以上）10 min，弃石油醚，再用 25 mL石油醚提取一次，弃石油醚，60 水浴挥发去除石油醚，残渣加 40 mL水 ，混匀，超声提取 20min，加 3 mL亚铁氰化钾溶液，混匀，再加入 3 m
10、L硫酸锌溶液，混匀，离心（2000 r/min）10min，过滤，用水洗涤残渣，收集滤液并定容至 100 mL，混匀备用。1.2.1.3试样溶液的制备液体试样（1.2.1.1）直接称取 2.00g-10.00 g于 50 mL带盖的离心管中，易乳化或浓度高试样可减小取样量并加水至 10 mL。固体、半固体试样移取上述已处理好的样液（1.2.1.2）10.0 mL 于 50 mL带盖离心管中。以备衍生化用。1.2.2标准溶液系列的制备准确移取 0.50 mg/mL环己基氨基磺酸钠标准使用溶液 0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL、10.0 mL于 5
11、0 mL带盖离心管中，加水至 10 mL。配成衍生化后进样液浓度相当于 0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.25mg/mL、0.50 mg/mL、1.0mg/mL 的标准溶液系列。 1.2.3试样溶液及标准系列溶液的衍生化把上述装有标准系列溶液（1.2.2）和试样溶液（1.2.1.3）的离心管放置在试管架上，置冰浴中，加入 2.5 mL 亚硝酸钠溶液，2.5 mL 硫酸溶液，盖紧离心管盖，摇匀，在冰浴中放置 30 min，其间振摇 3-5次；后准确加入 5.0 mL正庚烷，2.5 g氯化钠，盖上盖后置旋涡混合器上振动 1 min(或振摇 60-8
12、0次)，离心（3000 r/min）10min 分层或静置 20 min至澄清分层后取上清液以备进样用。1.2.4测定1.2.4.1色谱参考条件a)色谱柱: HP-5 型毛细柱（30 m0.32 mm，0.25 m，美国 Agilent Technologies公司）；b)柱温升温程序：初温 60保持 2 min，10 /min 升温至 90 保持 0.5 min，20 /min升温至 220 保持 3 min。c)进样口：温度 230 ；进样量 1 L，分流不分流进样 ，分流比 110(分流不分流、分流比可根据色谱条件调整） 。d)检测器：氢火焰离子化检测器（FID） ，温度 260。e)载
13、气：高纯氮气，流量 2.0 mL/min，尾吹 30 mL/min。f)氢气：30 mL/min；空气 330 mL/min（载气、氢气、空气流量大小可据仪器条件进行调整） 。1.2.4.2色谱分析分别吸取 1 L衍生化处理的标准系列各浓度溶液（1.2.3） ，注入气相色谱仪中，可测得不同浓度被测物的响应值峰面积或峰高，以浓度为横坐标，相应的峰面积值或峰高值为纵坐标，绘制标准曲线。同样进样 1 L衍生化处理的试样待测液（1.2.3） ，保留时间定性，测得峰面积或峰高，根据标准曲线得到进样液中的组分浓度；试样待测液响应值若超出线性范围，应用正庚烷稀释后再进样分析。平行测定次数不少于两次。1.2.
14、5分析结果的表述试样中环己基氨基磺酸钠含量按式（1）计算：X1= (1)fmC5式中：X1试样中环己基氨基磺酸钠的含量，单位为克每千克(g/kg)；C由标准曲线计算出进样液中环己基氨基磺酸钠的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL） ；m试样质量，单位为克(g) ；5正庚烷加入量，单位为毫升(mL) ；待测液稀释倍数。f以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。注：环己基氨基磺酸钠与环己基氨基磺酸的换算系数为 0.8909。1.2.6方法的精密度和准确度试验采用标准添加法分别进行回收率实验，取适量已知浓度或阴性样品加标高中低浓度至0.05 g/kg、0.2 g/k
15、g 和 0.5 g/kg、1.0 g/kg 等水平，混匀后称取 5 g左右，按 1.2.1提取、1.2.3衍生化、1.2.4 测定,每个水平测定 5次, 计算回收率。精密度试验：取适量已知浓度或阴性样品捣碎加标配成高中低浓度为 0.05 g/kg、0.2 g/kg、0.5 g/kg、1.0 g/kg 样品，混匀后取 5g左右，按 1.2.1提取、1.2.3 衍生化，按 1.2.4条件测定。计算精密度（n=5） 。2结果与讨论2.1 色谱图图 1 环己基氨基磺酸钠标准溶液衍生化处理后的气相色谱图（0.50mg/mL）图 2 检出环己基氨基磺酸钠试样芒果汁衍生后的气相色谱图（0.26g/kg）环己
16、基氨基磺酸钠标准品色谱图、检出环己基氨基磺酸钠残留样品色谱图分别见图 1、图 2。组分峰保留时间为 5.9 min。与原标准使用填充柱相比较，克服了溶剂拖尾的干扰，分离度可满足要求，可解决环己基氨基磺酸钠与杂质用填充柱难以分离的问题。2.2 标准曲线与检出限毛细管柱测定标准系列在 0.011.0mg/mL 范围内浓度和峰面积呈线形关系见图3。r=0.9996 显示线性关系良好。y = 770740x + 32243R2 = 0.999301000002000003000004000005000006000007000008000009000000 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2图 3 环己基氨基磺酸钠标准曲线检出限：以 3倍基线噪音（S/N=3）确定该方法质量检出限 1ng, 检出限浓度0.001g/mL
