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1、凝胶层析定义凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体 ，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。凝胶层析原理凝胶层析的概念及其原理单个凝胶珠本身象个筛子。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子 不但其运动路程
2、长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长!凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。凝胶层析分类葡聚糖凝胶是指由天然高分子 -葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。葡聚糖凝胶主要由Pharmacia Biotech 生产。常见的有两大类，商品名分别为Sephadex 和Sephacryl。葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex 系列，它是葡聚糖与3-氯-1，2环氧丙烷(交联剂)相互交联而成，交联度由2环氧丙烷的百分比控制。Seph
3、adex 的主要型号是G-10 G-200，后面的数字是凝胶的吸水率(单位是mL / g 干胶)乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5mL/g 干胶。Sephadex 的亲水性很好，在水中极易膨胀，不同型号的Sephadex 的吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。数字越大的，排阻极限越大，分离范围也越大。Sephadex 中排阻极限最大的G-200为810。Sephadex 在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的，可以多次重复使用。Sephadex 稳定工作的pH 一般为为210。强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所以要避免Sephade
4、x 与强酸和氧化剂接触。Sephadex 在高温下稳定，可以煮沸消毒，在100 C 下40 min 对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。Sephadex 由于含有羟基基团，故呈弱酸性，这使得它有可能与分离物中的一些带电基团(尤其是碱性蛋白)发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。所以在用Sephadex 进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液，这样就可以避免Sephadex 与蛋白发生吸附，但应注意如果盐浓度过高，会引起凝胶柱床体积发生较大的变化。Sephadex 有各种颗粒大小(一般有粗、中、细、超细)可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差;细颗粒
5、流速慢，但分辨率高。要根据分离要求来选择颗粒大小。Sephadex 的机械稳定性相对较差，它不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。另外，Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，形成LH 型烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为Sephadex LH-20和LH-60，适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。Sephacryl 是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺(N，N'-methylenebisacrylamide)交联而成。是一种比较新型的葡聚糖凝胶。Sephacryl 的优点就是它的分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108
6、，远远大于Sephadex 的范围。所以它不仅可以用于分离一般蛋白，也可以用于分离蛋白多糖、质粒 、甚至较大的病毒颗粒。 Sephacryl 与Sephadex 相比另一个优点就是它的化学和机械稳定性更高：Sephacryl 在各种溶剂中很少发生溶解或降解，可以用各种去污剂、胍、脲等作为洗脱液，耐高温，Sephacryl 稳定工作的pH 一般为311。另外Sephacryl 的机械性能较好，可以以较高的流速洗脱，比较耐压，分辨率也较高，所以Sephacryl 相比Sephadex 可以实现相对比较快速而且较高分辨率的分离。凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大
7、分子物质和小分子 物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质(1000-5000)的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管
8、壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。凝胶柱的使用（Superdex 10/300GL）1. 第一次使用或长时间保存后重新使用1.1 确保层析柱顶端接口充满溶液。1.2 确保连接层析柱的管线充满溶液，并以低流速(0.5ml/min)连接层析柱。1.3 至少 5倍柱体积去离子水平衡层析柱(0.5ml/min)，至少5倍柱体积洗脱液平衡层析柱。1.4 优先尝试的层析条件洗脱液：50 mM 磷酸盐缓冲液, 0.15 M NaCl, pH 7.0流速：0.50.75 ml/min上样体积：25 l (0.22m 滤膜过滤或
9、10000g 离心10min，浓度10mg/ml)确保层析柱承受压力不要超过其耐受最大压力。1.5 经过层析柱的所有溶液需要进行脱气并用 0.22m 滤膜过滤。2. 层析条件优化2.1 降低流速，提高高分子量蛋白分辨率，降低低分子量蛋白分辨率。2.2 减少上样体积，提高分辨率。2.3 改变有机溶剂浓度，改变选择性。2.4 两根层析柱串联，提高分辨率，控制 Superdex 75 10/300 柱压小于3MPa，Superdex 200 10/300 柱压小于2.5MPa。3. 层析柱清洗3.1 建议在层析柱清洗时采用反向流速。3.2 用25ml 0.5M NaOH 或者0.5M 乙酸清洗层析柱
10、(0.5ml/min)。3.3 立即用25倍柱体积去离子水冲洗层析柱，接着用至少5倍柱体积洗脱液清洗(0.5ml/min)。4. 常见问题处理4.1 层析柱反压升高或柱效下降。a 确保压力的升高是由层析柱引起的：检查在线滤器；从组分收样器开始断开管线，观察压力变化排除其他原因造成的压力升高。b 按照3的方案清洗层析柱。c 上样1倍柱体积1mg/ml 胃蛋白酶溶液（溶于0.1M 乙酸，0.5M 氯化钠），室温过夜或37 度1h，再按照3的方案清洗层析柱。4.2 层析柱进气泡用80100ml 进行很好脱气的去离子水平衡层析柱（0.5ml/ml），气泡会被逐渐带出层析柱；很少量的气泡不会影响层析柱柱
11、效（柱管内壁涂抹了一层塑料薄膜，小量气泡可能被吸附而不影响层析柱填料，而粗糙的表面不会影响层析柱柱效）。4.3 层析柱漏液a 确保是层析柱本身漏液。b 更换密封圈 。5. 层析柱溶液兼容性5.1 水相缓冲液 pH 3125.2 耐受 8M 尿素，6M 盐酸胍5.3 离子型和非离子型去污剂，30%乙腈，10%三氟乙酸，70%乙酸6. 层析柱超过两天不用或长时间保存用2 个柱体积脱气去离子水平衡，再用2 个柱体积脱气20%乙醇平衡。凝胶柱的使用（HiPrep Sephacryl）1. 第一次使用或长时间保存后重新使用1.1 连接层析柱1.2连接层析柱之前先打开系统泵排除管线及阀门里的气泡1.3 停
12、泵，垂直放置层析柱，移去层析柱入口处的堵头，将层析柱入口管线和层析系统连接。1.4 小心移去层析柱出口堵头，将其与层析系统相连接。1.5 平衡层析柱1.6 设置合适的报警压1.7 1.5柱体积去离子水平衡（15cm/h）1.8 2柱体积洗脱缓冲液平衡（30cm/h）1.9 优先尝试的层析条件洗脱液：50 mM磷酸盐缓冲液, 0.15 M NaCl, pH 7.2流速：15cm/h上样体积：柱体积的0.5%4% (0.22m滤膜过滤或10000g离心10min)确保层析柱承受压力不要超过其耐受最大压力经过层析柱的所有溶液需要进行脱气并用0.22m滤膜过滤。2. 如何测定柱后压和设置报警压2.1
13、用一根peek管代替层析柱连接于AKTA系统相应位置。2.2 使用层析时相同的缓冲液和流速运行系统，记录压力检测值为总压力。2.3 断开peek管连接，运行，记录压力值为柱前压。2.4 总压力减去柱前压为柱后压力。2.5 如果柱后压力超过0.35MPa，采取措施降低柱后压（缩短管线、清洗可能被堵塞的管道、更换限流阀），运行直至柱后压小于0.35MPa。2.6 将柱后压加0.15MPa作为系统报警压上限进行设置。3. 层析条件优化3.1 降低流速，提高分辨率。3.2 减少上样体积，提高分辨率。4. 层析柱清洗4.1 建议在层析柱清洗时采用反向流速（15cm/h，室温）。4.2用1.5倍柱体积的0
14、.2M NaOH清洗层析柱，接着用2倍柱体积缓冲液平衡层析柱。4.3如果缓冲液中含有去污剂需要用更多的溶液平衡直至UV基线稳定。更剧烈的清洗4.4 用0.5倍柱体积0.5M NaOH清洗（除去疏水性蛋白和脂蛋白），紧接着用4倍柱体积去离子水清洗层析柱。4.5 用1.5倍柱体积30%异丙醇清洗（除去脂类和非常疏水的蛋白），紧接着用4倍柱体积去离子水清洗层析柱。5. 常见问题处理5.1 层析柱反压升高或柱效下降。a确保压力的升高是由层析柱引起的：检查在线滤器；从组分收样器开始断开管线，观察压力变化排除其他原因造成的压力升高。b按照5的方案清洗层析柱。c上样1倍柱体积1mg/ml胃蛋白酶溶液（溶于0
15、.1M乙酸，0.5M氯化钠，降解沉淀在层析柱上的蛋白），室温过夜，再用1.5倍柱体积0.2M NaOH清洗，再用4倍柱体积去离子水清洗。dHiPrep层析柱不能打开或重新装填。5.2 层析柱进气泡用大量进行很好脱气的去离子水反相冲洗平衡层析柱（30cm/h），气泡会被逐渐带出层析柱。5.3 层析柱干裂或层析柱破损漏液：建议购买新的层析柱。6. 层析柱溶液兼容性6.1 使用脱气并用0.22um过滤溶液可以增加层析柱寿命。6.2 30%乙腈，0.5 M NaOH，24%乙醇，1M乙酸，30%异丙醇。6.3 水相缓冲液pH 3-11。6.4 6M盐酸胍，8M尿素。7. 层析柱超过两天不用或长时间保存用4个柱体积脱气去离子水平衡，再用4个柱体积脱气20%乙醇平衡层析柱，并连接堵头密封。凝胶层析的应用 脱盐：高分子(如蛋白质、核酸、多糖等)溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25%-30%，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等
