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1、标题：细菌革兰氏染色作业指导书版本号：A修订号：0文件编号：SMXGKYY -SOP-001发布日期：2015年04月01日生效日期：2015年04月01日发布部门：质量管理小组编制人：审核人：批准人（签字）： 革兰氏染色一、 目的更好的观察细菌形态，并可按染色反应加以分类鉴别。二、 原理1、 化学学说：碘液在菌体内与结晶紫结合后又和菌体内的核糖核酸镁盐蛋白质复合物结合，此结合物不易被95%乙醇脱掉，呈革兰氏染色阳性。因革兰氏阴性菌缺乏核糖核酸镁盐，故对碘与结晶紫结合物摄取少，且不牢固，易被乙醇脱色，而呈革兰氏染色阴性。2、 等电点学说：革兰氏阳性菌的等电点在PH23，比阴性菌（PH45）更低
2、。加之碘为弱氧化剂，可降低革兰氏阳性菌的等电点，使两类菌的等电点差异扩大。因此，阳性菌和碱性染料的结合力比阴性菌更强。3、 渗透性学说：阳性菌含粘肽多、糖多，酒精使其脱水而致细胞壁间隙缩小，通透性降低，在菌体内保留了染料碘复合物，故呈紫色。阴性菌胞壁含粘肽少，通透性不受影响，菌体内染料碘复合物较易透出，失去紫色，被复染成为红色。三、 标本痰涂片、分泌物涂片、细菌涂片等。四、 染液 第一液：结晶紫乙醇饱和液（2g结晶紫溶于95%乙醇20ml内）+10g/l草酸铵水溶液80ml混匀。 第二液：碘1g，碘化钾2g，加少许蒸馏水，充分振摇，溶解后加蒸馏水至300ml。 第三液：95%乙醇或乙醇、丙酮（
3、7：3）混合液。 第四液：稀释碳酸复红或沙黄溶液（2.5%沙黄乙醇液10ml加蒸馏水90ml混匀）（碱性复红8g溶于95%酒精100ml中制成饱和液，取10ml加入5%碳酸水溶液90ml混匀）用时用蒸馏水稀释10倍即可。五、 质量控制措施每周做一次革兰氏阴、阳性质控菌株染色对照（金葡菌、大肠杆菌）。六、 操作步骤1、 已固定的细菌（或其它）涂片，滴加第一液染1分钟水洗。2、 冲去残水滴加第二液，媒染1分钟，水洗。3、 去残水，用95%酒精脱色，至无明显紫色液渗出为止，水洗。4、 用第四液复染1030秒钟，水洗，干后镜检。七、 结果可报区间革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。八、 实验室解释
4、1、 染色关键在于涂片和脱色，故涂片要厚薄适宜。脱色时若涂片上有水分，则脱色力强，易形成假阴性。2、 涂片干燥宜自然干燥，固定时通过火焰三次即可，不宜过分，以免造成菌体变性而影响染色效果。3、 染色反应受菌龄影响，故所染色的细菌培养不超过2448h。九、 安全防护措施操作中，穿好工作衣，戴防护口罩、手套，必要时戴眼罩，严格按操作规程，结束后，用0.2%消毒灵擦拭实验台、显微镜手柄、载物台等，然后用0.2%消毒灵泡手，实验室用紫外线消毒30分钟。十、 标本处理已检验过的标本作高压灭菌后由专门人员统一处理。十一、参考文献 诊断细菌学，李仲兴等主编，第一版，香港：黄河文化出版社标题：细菌培养技术版本
5、号：A修订号：0文件编号：SMXGKYY -SOP-001发布日期：2015年04月01日生效日期：2015年04月01日发布部门：质量管理小组编制人：审核人：批准人（签字）： 细菌培养技术目的：无菌操作接种、培养是细菌学实验室中最基本、最重要的操作技术，它是鉴定细菌的首要前提。器材：酒精灯、95%酒精、接种环（针）、培养皿（瓶）、烛缸、火柴等。一、 无菌操作技术的基本要求1、 临床细菌检验的所有操作，均必须在无菌条件下进行，即在酒精灯火焰附近或在超净工作台内进行。2、 由临床标本或培养物中取材作检查时，必须使用接种环（针），使用前后均需火焰灭菌。3、 从培养瓶或试管培养物中取标本时，在打开瓶
6、口、试管口或关闭前，均要在火焰上通过12次，瓶塞或试管塞用无名指及小指夹住，操作完毕后塞回。4、 不慎打破培养物瓶（管）时，应报告负责人后，用0.2%消毒灵处理污染的台面或至少覆盖30分钟。打破的器皿集于容器内高压灭菌，台面及地面再进一步消毒清洗。5、 工作完毕后，实验台用0.2%消毒灵擦拭，双手用0.2%消毒灵浸泡，再用肥皂和清水刷洗干净。.二、 接种方法（一） 平板接种法：平板划线接种是细菌分离培养的常用技术，主要使标本或培养物中的混合细菌能在培养基表面分散生长形成单个菌落。1、 曲线划线分离法：接种环菌灭后挑取标本或菌液少许呈45度角，在平板1/5处轻轻涂布，然后左右来回以曲线形成划线接
7、种，倒置37温箱内培养24h后观察结果。2、 分区划线分离法：接种环于平板内分划五区，每划完一个区域烧灼环一次后倒置3537培养。（二） 穿刺接种法：多用于保存菌种观察动力及做厌氧培养，亦可用于观察细菌对糖类的分解反应，培养基为半固体。方法：1、左手持细菌培养物。 2、右手持接种针酒精灯上烧灼，冷却后挑取细菌。 3、左手持半固定培养基，右手小指夹住棉塞并取下，管口火焰灭菌，将接种针插入培养基中央，穿刺近底部1/3处，再沿原穿刺线抽出在斜面上做连续曲线接种。 4、试管口在火焰上充分灭菌，塞棉塞，灭菌接种针。 6、接种后的半固体培养基，置试管架上，3537孵育箱培养三、 培养方法（一） 一般培养法
8、（又称需氧培养法）：将已接种好的平板、斜面和液体培养基等，置3537孵育箱中1824h，难以生长者培养27天甚至半个月。（二） 二氧化碳培养法：将某些细菌如脑膜炎球菌，嗜血杆菌等置于CO2环境中进行培养。我室采用烛缸法：将已接种过的平板，置于有盖的干燥玻璃缸中，缸盖及缸口涂凡士林，放入已点燃的蜡烛，用盖密闭，蜡烛数分钟后自行熄灭，此时缸内均含510%CO2。最后将缸移入35孵育箱中培养。（三） 厌氧培养法四、参考文献诊断细菌学，李仲兴等主编，第一版，香港：黄河文化出版社，1992标题：临床细菌学室内质量控制版本号：A修订号：0文件编号：SMXGKYY -SOP-001发布日期：2015年04月
9、01日生效日期：2015年04月01日发布部门：质量管理小组编制人：审核人：批准人（签字）： 临床细菌学室内质量控制目的：细菌室内质控是细菌检验工作的核心，是做好室间质评的基础和前提，做好此项工作，才能在室间质评中取得好成绩，也就能更好地为患者的诊疗服务。一、细菌检验人员及其培养教育：须在实践中继续学习，不断提高理论水平和技术操作能力，编写操作手册。二、仪器设备的功能监测（一） 灭菌器械的效果监测：高压灭菌器每月一次，我室采用嗜热脂肪芽胞杆菌监测。（二） 恒温孵育箱、水浴箱及冰箱，每天记录其温度，开始工作及工作结束时均应记录，并绘制温度控制图，孵育箱温度应为351，水浴箱370.5，冰箱冷藏为
10、42，冷冻为-205三、培养基的质量控制（一） 制备培养基的记录：包括收到日期，制备时培养基名称、配方、日期，制作者签名。成品培养基记录购入日期及使用日期，并按条件贮存，用已知阳性或阴性菌株进行检测。（二） 培养基的外观检查：对制备或购入成品培养基，要观察其颜色和透明度。发现异常要停止使用。（三） 培养基的性能监测：对于分离、选择、鉴别培养基，要对其用参考菌株进行监测，性能符合标准方可使用。四、 试剂、染色液及抗血清的质量控制试剂、染液，配制后注明名称，配制日期及配制者，用已知阳性和阴性参考菌株进行监测，合格后方能应用。（一） 根据试剂和染色液本身稳定性和使用频度定期检查核对：较稳定如靛基质每
11、周检测，H2O2每天用时均应检测，氧化酶纸片应避光低温保存，各种生物制品应置4冰箱保存等。（二） 抗血清的质量控制：应记录收到日期，观察其外观是否符合标准，使用时前先用已知阴、阳性菌株检查是否合格，期间每三个月用标准菌株检测一次其敏感性及特异性，有效期内使用，置4冰箱保存。五、 处理临床标本的质量控制（一） 标本采集和运送1、 标本采集（1） 时间：早期、急性期、症状典型时或用药前。（2） 方法：据不同的菌种而不同。（3） 技术：除痰、粪、肛拭子、咽拭子等，均应无菌操作并盛于无菌容器内。（4） 量：不得过少，要具代表性。（5） 防护：注意安全，防污染，传播和自身感染。2、 标本运送：最好床边接
12、种，须运送时，视标本情况和培养目的作保温、冷藏、厌氧运送或将标本种入培养基内送检。（二） 直接涂片：除血标本外，几乎所有临床细菌标本均应做直接涂片。（三） 分离培养和鉴定1、 分离培养：据标本性质，临床诊断，直接涂片染色镜检结果，选择适当培养和培养方法。2、 鉴定：按科、属、种顺序进行。六、 质控用标本菌株（一） 具备条件：形态染色反应，生理生化及血清学特性典型而稳定。（二） 来源：质控中心或研究所均可提供。（三） 保存：冷冻干燥法、超冰冻保存法、培养基保存法。七、抗生素敏感试验的质量控制细菌对抗生素的敏感试验，对临床医师选择适当的抗生素治疗感染性疾病十分重要，也是合理，安全用素的前提，故须做好抗生素敏感试验的质量控制，多采用纸片扩散法和稀释法进行。质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希氏菌ATCC25922、绿脓杆菌ATCC27853，用来测定方法的准确性。7
