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1、 无菌检验方法适用性试验方案目 录1.概述1.1试验背景为保证无菌检验结果的准确可靠，当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的适用性试验，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计，所采用的方法适合于该产品的无菌检查。按照中国药典2015年版四部“通则1101无菌检查法”要求，检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，检查方法应进行重新试验。根据2015年版药典及药品微生物实验室质量管理指导原则要求，检测环境由原来的为C级背景下局部A级空气单向流，在层流净化工作台下进行无菌检测，变更为在C级背景下，无菌检查ORABS隔离系统中进行无菌检测,且由原来的臭氧消毒，变更为臭氧+过氧化
2、氢灭菌消毒；培养基发生变更：由培养真菌用的改良马丁培养基变更为胰酪大豆胨液体培养基，培养温度由23-28变更为20-25，现针对XXX注射液进行适用性试验，以证明所采用的方法适合该药品的无菌检查。1.4方案说明验证过程中严格按照经批准的方案规定的内容进行，若因特殊原因需要变更时，应填写方案变更申请及批准书，报试验领导小组批准。2.确认目的按照中国药典2015年版四部“通则1101无菌检查法”规定对小儿氨基酸注射液无菌检查方法进行试验，在现有检验程序、检测条件及培养条件下，对该供试品的适用性试验进行确认，证明所采用的方法适合该药品的无菌检查。验证过程中应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因
3、确需变更时，应填写验证方案变更申请及批准书，报验证领导小组批准。3.小组人员4.风险评估4.1风险等级标准A.严重程度（S）：测定风险的潜在后果，分为以下四级：评分严重程度描述4关键直接影响产品质量要素或工艺与质量数据的可靠性、完整性或可追踪性，可能导致产品不能使用，直接影响GMP原则，危害生产区活动。3高直接影响产品质量要素或工艺与质量数据的可靠性、完整性或可追踪性，可能导致产品召回或退回，未能符合一些GMP原则，可能引起检查或审计中产生偏差。2中（不重要的）对产品或数据无相关影响，但间接影响产品质量要素或工艺与质量数据的可靠性、完整性或可追踪性，可能造成资源的严重浪费或对企业形象产生较坏影
4、响。1低（可以忽略）对产品或数据无相关影响，但对产品质量要素或工艺与质量数据的可靠性、完整性或可追踪性仍产生较小影响。B.可能性程度(P)：测定风险产生的可能性，为建立统一基线，建立以下四个等级：评分可能性描述4极高极易发生，约一星期一次或者更频繁3高偶尔发生，约一个月一次2中很少发生，约一年一次1低发生可能性极低，三年甚至更长时间都不大可能发生C.检测能力（D）：在潜在风险造成危害前，检测发现的可能性，设为以下四个等级：评分检测能力描述4极低失败很可能被忽视，因此没有检测到（无检测机制，无人工或视觉校验）3低不检测，但可能被发现，如：作为现场检查的审计2中定期检测，如：常规的手动控制或分析可
5、检测到错误1高始终检测到，如：自动控制装置到位，故障报警或错误后无法下一流程操作风险分析及评价：根据确定的风险标准对已经识别并分析的风险进行评价，即通过评价风险的严重性和可能性从而确认风险的等级。质量风险优先级别评价标准如下：RPN/严重程度风险级别风险处理优先等级RPN16或S=4高等风险高优先8RPN16中等风险优 先RPN7低等风险忽 略风险优先系数（RPN）计算：严重程度（S）可能性程度(P)检测能力（D）。风险水平的划分： RPN16 或严重程度=4高风险水平：此为不可接受风险。必须尽快采用控制措施，通过提高可检测性及/或降低风险产生的可能性来降低最终风险水平。验证应首先集中于确认已
6、采用控制措施且持续执行。由严重程度为4 导致的高风险水平，必须将其降低至RPN 最大=8。 16RPN8中等风险水平：此风险要求采用控制措施，通过提高可检测性及/或降低风险产生的可能性来降低最终风险水平。所采用的措施可以是规程或技术措施，但均应经过验证。 RPN7低风险水平：此风险水平为可接受，无需采用额外的控制措施。4.2风险的确认无菌检查结果不成立4.3 风险的分析及评价4.4依据风险分析及评价结果需实施的确认项目5.试验前准备5.1文件确认序号文件/资料编号存放地点123456检查人： 检查日期： 复核人： 复核日期：5.2.仪器确认：5.2.1确认检测设备已经检定并在有效期内使用。5.
7、2.2确认检测设备运行良好，且满足检测需要。设备名称型号编号检定有效期至运行检查智能集菌仪培养箱培养箱检查人： 检查日期： 复核人： 复核日期：5.3物料、培养基和冲洗液的确认5.3.1确认物料、培养基是否在有效期内使用5.3.2确认物料、培养基储存条件、性状符合要求。品名（试验物料）规格批号有效期生产厂家集菌培养器品名（已配制培养基）固体批号厂家配制日期批号有效期硫乙醇酸盐流体培养基胰酪大豆胨液体培养基沙氏葡萄糖肉汤培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基0.9%无菌氯化钠溶液0.05%（v/v）聚山梨酯80的无菌氯化钠溶液胰酪大豆胨琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基5.3预培养及灵敏度实验检查5.3.1确认
8、培养基已经预培养实验，并预培养合格。5.3.2确认培养基已经灵敏度试验检查，并合格。 预培养：胰酪大豆胨液体培养基见【XXXXXX】硫乙醇酸盐流体培养基见【XXXXXX】品名批号培养日期培养条件操作人结果判断胰酪大豆胨液体培养基日 时- 日 时硫乙醇酸盐流体培养基日 时- 日 时灵敏度实验：胰酪大豆胨液体培养基见【XXXXXX】硫乙醇酸盐流体培养基见【XXXXXX】品名批号培养日期培养条件操作人结果判断胰酪大豆胨液体培养基日 时- 日 时硫乙醇酸盐流体培养基日 时- 日 时5.4菌种确认：5.4.1确认菌种有效期在合格范围内。名称代数编号金黄色葡萄球菌大肠埃希菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌白色念珠菌黑
9、曲霉6.菌液制备6.1. 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035C培养182 4小时；取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌斜面菌苔至3mlXXX注射液中混匀，取1ml至空比浊管与标准比浊管比浊，以至即为100。取100菌液1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，做为10-1稀释液，依次稀释至10-8。取10-510-8稀释级按平皿计数法计数菌落数，根据结果取菌落数小于100cfu的稀释级作为试验菌液。6.2接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035C培养182 4小
10、时后，取上述培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，做为10-1稀释级，依次稀释至10-8。取10-510-8稀释级按平皿计数法计数菌落数，根据结果取菌落数小于100cfu的稀释级作为试验菌液。6.3接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，2025C培养244 8小时，上述培养物用0. 9%无菌氣化钠溶液制成每lm l含菌数小于lOOcfu(菌落形成单位）的菌悬液。取上述培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，做为10-1稀释级，依次稀释至10-8。取10-510-8稀释级按平皿计数法计数菌落数，根据结果取菌落数小于100cfu的稀释
11、级作为试验菌液。6.4接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，2025C培养57 天，加人35m l含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0. 9 %无菌氣化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用管口带有能过滤菌丝的装置（如薄的无菌棉花或纱布的无菌毛细吸管）吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05% (m l/m l)聚山梨醋80的0. 9 % 无菌氯化钠溶液加入0.9%无菌氯化钠溶液中，作为10-1稀释级。依次稀释至10-8。取10-410-8稀释级按平皿计数法计数菌落数，根据结果取菌落数小于100cfu/ml的稀释级作为试验菌液。6.4.1.计数结果 取上述各稀释级各种菌悬液或孢子悬液
12、1ml，分别用融化后45左右的胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基15ml20ml注皿，各平行测定两皿。胰酪大豆胨琼脂培养基在3035培养48小时，沙氏葡萄糖琼脂培养基在2025培养72小时，计数l。表1 平皿计数法，各对照菌菌落计数结果，单位：cfu/ml菌种金黄色葡萄球菌大肠埃希菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉菌稀释级计数平均6.5正式试验6.5.1样品信息：产品名称规格包装形式玻瓶灭菌条件批号1有效期至1批号2有效期至2批号3有效期至3生产单位6.5.2试验步骤：6.5.2.1产品试验：取同一批次的供试品60瓶，分成六组，每组10瓶。共取三个批次，共计18组。6.5.2.2产
13、品试验：将同一批次的供试品60瓶分六组，每组10瓶。6.5.2.3按薄膜过滤法将一组供试液过滤至一只滤筒内，过滤完毕，加入硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基，然后加入小于100cfu/ml的试验菌。另一管滤加入同等体积同种培养基，再加入等量试验菌，作为对照。按规定温度培养，培养时间不得超过5 天。各试验菌同法操作。6.5.2.4重复上述操作，做完另五组供试液。6.5.2.5重复三批试验。6.5.2.6每个试验菌每天只需做一次阳性对照。6.5.3结果判断：6.5.3.1与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检验法和检验条件进行供试品的无菌检查。6.5.3.2如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则
