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1、第三章 农用抗生素,一、农用抗生素起源与进展,在微生物学基础上发展起来的抗生素作为一门科学，在人类对自然界微生物的相互作用，特别是对微生物拮抗现象的研究中得以迅速发展。 二千多年前，我国就利用豆腐上的霉来治疗痈症，这是人类历史上利用抗生素治疗疾病最早的记载。 1929年从青霉菌的培养液中分离得到对金黄色葡萄球菌有较强杀灭活性的青霉素，并证明它的临床效果，深受人们的重视，由此抗生素逐步得到了发展。 1944年发现的红霉素 1947年发现的氯霉素 1948年发现的四环素,抗生素在临床用于治疗细菌引起的感染、抗肿瘤、抗病毒、抗原虫、抗排异、抗血凝、抗过敏等，同时对功能性疾病的治疗以及促进生物生长发育
2、也是有效的，因此抗生素早已突破了“抗菌”的概念。 实际上抗生素是由包括微生物、植物、动物在内的生物在其生命过程中所产生的次级代谢产物，它是一类“天然有机化合物”，具有选择性地抑制或杀灭细菌或其他细胞以及具有其他生理活性的功能。但目前来说，微生物是产生抗生素的主要来源。,一、农用抗生素起源与进展,由微生物产生的代谢产物作为农药即农用抗生素 农用抗生素在作物生产上的应用主要是防治作物病害、虫害、草害以及植物生长调节素和抗病毒制剂等方面，它和化学农药的主要区别在于前者是生物合成的，后者是人工合成的产物。 在二十世纪五十年代，为了防治某些病害，人们曾将医用抗生素作为农用抗生素使用，如美国、英国、日本等
3、先后把链霉素、土霉素、灰黄霉素等用于防治植物病害，同时又开发了放线酮、抗霉素A等一些抗生素，由于成本和性能等问题，竞争不过化学农药，以致发展缓慢。 1958年日本见里等人成功开发了灭瘟素S(Blasticidin-S)，替代有机汞制剂，用于防治稻瘟病，并于1963年闯过了成本和药害两关，在近千亩水稻田大规模使用，取得显著效果，从而掀起了开发农用抗生素的热潮 尤其在日本，成为开发新农用抗生素的主体，相继开发出春日霉素、多氧霉素、有效霉素等杀菌抗生素，以后又开发了杀螨素、双丙氨磷等杀虫和除草抗生素。,一、农用抗生素起源与进展,我国农用抗生素的研究始于五十年代，以筛选杀菌抗生素和植物生长调节剂为代表
4、。 六十年代我国研制成功了放线菌酮和灭瘟素，并成功投入工业生产。 七十年代研制成功了春日霉素、庆丰霉素、井冈霉素、多抗霉素。 八十年代研制成功了公主岭霉素、多效霉素、农抗120、杀蚜素、浏阳霉素等。 九十年代又研制成功了中生菌素、武夷菌素、宁南霉素、华光霉素、梅岭霉素和阿维菌素等。 目前，农用抗生素已成为世界农药市场中不可缺少的一部分。上述这些农用抗生素，加上最早作为植物生长调节剂的农用抗生素赤霉素，使农用抗生素遍及农药的所有领域，作为化学农药的互补制剂，农用抗生素越来越引起人们的注意。 此外，由于化学农药及其他传统农药所产生的抗性问题，人们对农用抗生素的开发日益受到关注，许多新的农用抗生素相
5、继问世。,一、农用抗生素起源与进展,农用抗生素主要由细菌、真菌和放线菌等微生物产生。 细菌产生的抗生素，大多是多肽，也有一些其他类别的抗生素。 真菌的四个纲中 半知菌纲(Fungi imperfecti)中产生的抗生素比较重要，如桔霉素、青霉素、头孢菌素等，这些抗生素大多属于酸类，少数属于醌类结构。 藻菌纲(phycomyces)和子囊菌纲(Ascomycetes)产生的抗生素不多，担子菌纲(Basidiomycetes)产生的抗生素是在二十世纪七十年代后才引起重视的，主要是发现了多糖和糖肽类物质。,卵菌 子囊菌 半知菌 担子菌,放线菌产生的抗生素化学结构多种多样，性质也不一致，迄今由微生物产
6、生的几千种抗生素中，80%左右是由放线菌产生的，因此放线菌一直是研究新抗生素工作者的主攻方向。 本章主要叙述农用抗生素的筛选、开发及应用。,二、农用抗生素的筛选,自从青霉素发现以来，由于筛选方法不断改进、扩大和创新，抗生素已从人类临床应用扩大到用于防治农作物植物病害和防治动物疾病。 农用抗生素的筛选已在分子生物学、酶学、遗传学等发展的基础上，向着各种生物活性方面发展，如农用杀虫剂、杀菌剂、植物抗病毒剂、除草剂、植物生长调节剂等。,（一）微生物菌种的采集,微生物在自然界分布广泛，土壤、动植物体、河川、湖底、海洋和空气中都能检测出许多种类，尤其在土壤中，微生物不仅种类多，而且数量大。 真菌和细菌存
7、在于近地面的地方，放线菌在较深处。 采集土壤、分离菌株以春、秋两季为宜。 由于放线菌的数量和种类在很大程度上与土壤有机物有关，因此采土时要注意取土的深浅和位置，要除去粗大的有机残渣。 近年来，为了扩大筛选新抗生素的来源，从土壤微生物扩展到海洋微生物，从一般常见菌扩展到了特殊菌株。,将微生物样本取来后，取少量直接混入培养基内或喷于培养基上，于28培养，细菌培养12天，放线菌、真菌可在34天挑菌一次或56天挑菌一次，不同要求可采用不同的温度。 放线菌挑菌的斜面培养基可用高氏1号，真菌用察氏培养基。也可根据自己的要求选择培养基，在培养基中添加抗生素或化学药剂，或添加特殊营养，希望能分离出稀有的放线菌
8、。 移好斜面后进行培养，然后作菌种初步鉴别和筛选，适当淘汰一些相似性较多的菌种，然后在低倍镜下观察其孢子丝形态再淘汰，这样做比较可靠。,含微生物样本的采集、微生物菌株分离、培养及对不同病、虫、草害靶标生物活性测定，有效活性物质的早期理化鉴别，有效菌株及其代谢活性物质的精制鉴别，查新检索、申请专利、新抗生素开发研究应用于生产实践 含微生物样本的采集 土样采集可从全国各地，尤其是南方，最好是采未耕作土，因未耕作土中具有抗菌活性的放线菌比耕作土中出现的比率要高，而且最好采离表土5厘米左右处的土，因表土中细菌多，较深处的土中放线菌减少，有气生菌丝的放线菌更少。 土样预处理将所采土样风干，去除杂物，磨碎
9、，最好经真空干燥器减压干燥后保存，这样可大大减少土样细菌量。,（二）微生物菌的分离,目前我们主要是分离土样中的放线菌，尤其是链霉菌属放线菌。 分离培养基为了充分将所采集的含微生物样本中的各类微生物分离出来，我们分别采用腐殖酸培养基、高氏培养基、改良燕麦培养基、无机淀粉及由葡萄糖20克、酵母汁2克、肉膏2克、琼脂13克、蒸馏水1升、pH7.2组成的培养基等进行分离培养。 土样悬浮液稀释与涂皿用灭菌水将土样稀释后，将0.1ml土样稀释液滴加到含有1820ml上述分菌培养基的9厘米平皿中，用玻璃推棒涂抹均匀，置28培养12周，也可高温培养。 斜面培养基（1）高氏1号培养基；（2）改良燕麦粉培养基；（
10、3无机淀粉培养基；）（4）可溶性淀粉5.0克，葡萄糖5.0克，蛋白胨1.0克，酵母膏1.0克，肉膏1.0克，琼脂粉14克，蒸馏水1升，pH7.2。 在同一批土样分离时，斜面培养基最好统一成一种，便于菌的比较。,（三）培养基,培养基是人工配制的，适合于不同微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养物质。培养基的组成和配比对菌体的生长发育、发酵单位、提取工艺、产品的产量和质量都有相当大的影响。因此必须重视培养基的研究。 培养基的成分 : 虽然不同微生物需要的营养条件有所不同，但所有微生物发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的能源、碳源、氮源、无机元素、生长因子以及水、氧气等营养物质。 1、碳
11、源主要用来供给菌体生命活动所需的能量，构成菌体细胞和代谢产物碳架来源的物质，是发酵的主要原料之一。 2、氮源构成菌体细胞物质和含氮代谢物。,碳源: 类别 元素水平 分子水平 原料来源 有机化合物 CH化合物 烃类 石油、天然气等 CHO化合物 糖、有机酸、醇 糖类（葡萄糖、 麦芽糖、乳糖）、 淀粉、糊精、乳酸等 CHON化合物 蛋白质及其降解产物 蛋白胨、氨基酸等 CHON“X” 复杂的有机物 牛肉膏、油和脂肪等 无机化合物 碳酸盐等 氮源: 有机化合物 CHON化合物 蛋白质及降解物 玉米浆、花生并粉、 棉子并粉、蛋白胨、 鱼粉、黄豆并粉等 无机化合物 NO NO3- 硝酸钾、纳等 NH N
12、H3、NH4 氨水、（NH4）2SO4等,3、无机盐类和微量元素：生长必不可少的大量元素有P、S、Mg、K、Na等，维持在10-310-2。微量元素有Zn、Cu、Fe、Mo、Mn、Co等，维持在10-610-8。它们中“P”是核酸，核蛋白等重要细胞物质的组成部分，也是多种辅酶、高能磷酸键的组成部分；“S”也是菌体细胞蛋白质的组成部分，是参与合成含硫氨基酸的元素；“Fe”是细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的组成部分；“Zn、Mg、Co”等都是某些酶的辅基或激活剂；“Na、K、Ca”等离子能维持菌体细胞的渗透压，调节细胞透性等。 4、生长因子类前体物质：主要是维生素、氨基酸、嘧啶、嘌呤等碱基，是用来构成
13、抗生素分子而本身又没有显著改变的物质。它们除直接参与抗生素的生物合成外，在一定条件下还控制菌体合成抗生素的方向和产量。这些物质有的是菌体本身能合成的，有的不能合成或很少，需从外界加入，以利于更有效地促进菌体生长或提高抗生素产量。 5、水：是微生物细胞的主要组成成分，一般细菌细胞含水7585，酵母菌含水7080，霉菌含水7590。水可以维持细胞膨压，是完成微生物细胞进行生化反应的良好介质。,培养基的种类及其选择,1、培养基的种类： A、按对成分的了解程度可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基。 天然培养基利用化学成分不太清楚或化学成分还不稳定的天然有机物所配成的培养基。例如：肉汁蛋白冻等。其
14、特点是配制方便，成本也较低，适于大规模培养微生物用及实验室研究。 合成培养基化学成分完全了解的物质所配成的培养基。例如查氏培养基：由NaNO3 2g、K2HPO4 1g、KCL 0.5g、MgSO47H2O 0.5g、FeSO47H2O 0.01g、蔗糖30g、琼脂1520g、水1000ml，PH自然。多用于真菌培养用。 半合成培养基在天然物中加入已知化合物配成的培养基。例如肉汁培养基：牛肉膏 3g、蛋白胨 10g、NaCL5g、琼脂1520g、水1000ml，PH7.0，此培养基适于细菌培养用。另外，PDA培养基（即常用的马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基）等。 B、按物理性状分，有固体培养基、半固
15、体培养基、液体培养基等 固体培养基直接用固体原料或在上述配制的培养基中，加入一定的凝固剂（如琼脂）配成的培养基。此培养基用途广泛，可用作微生物菌种分离、鉴定、保藏、计数和固态发酵等。 半固体培养基在培养基中加入少量凝固剂所配成的培养基。此培养基可用以观察细菌运动、菌种鉴定、测定噬菌体效价等。 液体培养基不加凝固剂成液态状培养基。用途广泛，可作微生物生理研究，可大规模工业发酵等。,培养基的种类及其选择,C、按培养基作用，可分成基本培养基、特殊培养基、鉴别培养基等： 基本培养基根据微生物营养需要的基本营养成分配制的培养基。 特殊培养基自然界多数微生物都混在一起生长，为了某种需要，使一种能生长，而另
16、外不生长。即适合于某种微生物生长而不利于其他微生物生长的培养基叫特殊培养基。例如：丙稀腈转化成丙稀酰胺 AMAN 其培养基为：K2HPO4 2g/L、NaCL 1g/L、MgSO47H2O 0.02g/L、甘油 5g/L，另外加腈类化合物0.15g/L（丙稀腈、异丁腈等），就可找出能否产腈水合酶。特殊培养基的用途，可创造有利环境分离有利微生物的生长条件或创造特殊营养要求或创造特定的环境条件（PH、温度等），可控制其他杂菌的生长（加抑制剂等）。 鉴别培养基根据微生物的代谢特点，通过指示剂的显色来用于鉴别不同的微生物。例如：肠道杆菌G- 能发酵乳糖的话：如发酵能力强，产生紫色，为EColi；如发酵能力弱
