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1、基因工程,Mendel G.J. (1822-1884). 1856-1864豌豆杂交实验。,基因工程发展史,1909年Yohannsen W.L. (1859-1927) 发表了“纯系学说”首先提出了“基因”的概念，代替了Mendel “遗传因子” 的 概念。,基因概念的提出,1910年以后，Morgan T.H.等提出了基因的连锁遗传规律,1941年，Beadle G.W.等证明了基因通过酶起作用，提出了“一个基因一个酶”的假说,一个基因一个酶,1944年，Avery O.T.利用肺炎双球菌转化实验,分子遗传学的诞生,Nireberg等为代表的 一批科学家,“中心法则”的提出,原核生物的基
2、因调控操纵子模型,1961年，Jacques Monod和 Fancois Jacob提出了原核基因调控的 操纵子模型 （operon model）。,Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind II， 1972年，Boyer等相继发现了coR I 一类重要的限制性内切酶。,基因工程工具酶的发现和应用,1967年，世界上又五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年Khorana等发现的T4 DNA连接酶具有更高的连接活性。,1970年，Baltimore等和Temin等各自发现了反转录酶，完善了中心法则，使真核基因的制备成为了可能。,1972年，美国Stanford大学的P.
3、Berg 等首次成功地实现了DNA的体外重组；,1973年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。 这一年被定为基因工程诞生的元年。,DNA生命的秘密,1 基因是什么,1928年，英国 Griffith S型肺炎球菌：有荚膜，菌落表面光滑 R型肺炎球菌：没有荚膜，菌落表面粗糙,著名的肺炎球菌实验,结果说明？,1952年，Hershey 和 Chase 病毒（噬菌体） 放射性同位素35S标记病毒的蛋白质外壳，32P标记病毒的DNA内核，感染细菌。 新复制的病毒，检测到了32P标记的DNA，没有检测到35S标记的蛋白质， DNA在病毒和生物体复制或繁殖中的关键
4、作用。 8年的时间,更有说服力的噬菌体实验,1958，Meselson和Stahl 大肠杆菌 15NH4CI为唯一氮源的培养液中生长若干代 被15N标记的大肠杆菌转入14NH4CI为唯一氮源的培养液中 完成第一代和第二代繁殖时， 分离DNA，密度梯度超速离心 被15N标记的亲代双链DNA（记作15N/15N）密度大，在下部；14N/14N密度小，在上部；15N/14N在15N/15N和14N/14N之间,2 DNA的半保留复制,DNA合成的同位素示踪实验,重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。 所谓基因工程(genetic engineering)就是有意识地把一个生
5、物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。,3 重组DNA技术是基因工程的核心技术,重组DNA操作一般步骤：,（1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子； （3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传； （4）对转化子筛选和鉴定； （5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。,获得需要的目的基因常用的方法： （1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(gene library)，从中调用目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段 （3）利用聚合酶链式
6、反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。,1)获得需要的目的基因（外源基因）,细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建,细胞内总DNA的提取分离程序,紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度。,基因文库的构建 将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。,反转录人工合成互补DNA,构建基因文库获取目的基因存在的问题 费时费事 内含子序列,反转录人工合成互补DNA方法的优势 获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因,聚合酶链式反应（PCR）,PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。,加入4种物质：
7、 （1）作为模板的DNA序列； （2）与被分离的目的基因两条链 各自5端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）； （3）TaqDNA聚合酶； （4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。,聚合酶链式反应（PCR）,变性、退火、延伸三步曲,变性：双链DNA解链成为单链DNA 退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,聚合酶链式反应（PCR）,每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍,30轮循环可获得 230（1.07109)个基因片段,DNA合成仪,PCR扩增仪,PCR技术的发明,PCR的发明是
8、DNA操作技术的革命 美国Mullis教授 开汽车时的联想,逶迤崎岖的山路DNA双螺旋 行驶的汽车一小段DNA引物 1988年发明了PCR技术 1993年获得诺贝尔奖,基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性内切酶、载体和宿主菌。 微量的目的基因必须经过基因克隆获得大量的拷贝后，才能实现进一步的重组、转化和表达等操作。,2) 构建重组质粒和基因克隆,限制性内切酶,限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定位点分子手术刀 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖,限制性内切酶,已经发现和鉴定了200多种,
9、EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段 粘性末端 T4连接酶,载体,载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目前最常用的载体包括细菌质粒、l噬菌体、cosmid质粒等。 质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。,1该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。 2进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可复制形成大约500个拷贝。 3在pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种限制性酶切位点的序列，即多克隆位点,细菌质粒pUC18,pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插
10、入外源目的基因，lacZ基因便可表达出半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG和X-gal，X-gal便会被半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。 在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆,4利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒,5pUC18还携带了氨卞青霉素抗性基因，可筛选重组质粒,以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆,将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤： 1获得目的基因和质粒载体； 2形成重组质粒； 3制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞； 4培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝； 5筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查
11、或鉴定。,多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,一般克隆基因的检查和鉴定方法,琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段： 磷酸基团带负电荷 酶解片段向阳极移动 电场驱动力和凝胶阻力 不同迁移率 分子量标准参照物,酶切和电泳方法,32P标记的DNA分子探针 杂交 放射自显影法,DNA杂交直接鉴定,若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对转化的大肠杆菌进行培
12、养使目的基因大量表达和积累。对表达产物分离纯化便可获得想要的产品。 通过DNA体外重组技术构建的重组质粒还可以直接用以转化蓝藻等原核生物或其他一些原生生物,3) 转化受体细胞和转化子的筛选,构建缺失chlL基因的蓝细菌突变株,遗传转化常用的方法,载体法转化农杆菌介导法 基因的直接转移 （1）高压电脉冲电激穿孔 （2）基因枪法 （3）微注射法,纪念发明者Edward Southern （1）提取总DNA （2）酶解 （3）电泳 （4）转移到滤膜 （5）变性解链 （6）DNA探针及杂交 （7）洗脱 （8）放射自显影 （9）比较分析,4) 转化子的分析Southern杂交,Southern杂交分析示
13、例,A. DNA体外重组实验 B. 抗生素筛选转化子细胞 C. 培养突变株细胞 D. Southern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中,1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组，一举打开了基因工程学大门。, 基因工程的应用 ）医药卫生,基因工程药品的生产,许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。 微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。,基因工
14、程的应用 胰岛素（一）,胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。,胰岛素分子结构,基因工程胰岛素（二）,将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！,胰岛素生产车间,基因工程干扰素（一）,干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说,干扰素生产车间,干扰素分子结构,基因工程干扰素( 二）,基因工程人干扰素-2b（安达芬） 是我国第一个全国产化基因工程人干扰素-2b，具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免
15、疫功能的作用,其它基因工程药物,人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。,人造血液及其生产,基因诊断与基因治疗,运用基因工程设计制造的“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。通过基因工程给患有遗传病的人体内导入正常基因可“一次性”解除病人的疾苦,我国研究人员正在制备用于基因治疗的基因工程细胞,SCID的基因工程治疗,重症联合免疫缺陷（SCID）患者缺乏正常的人体免疫功能，只要稍被细菌或者病毒感染，就会发病死亡。这个病的机理是细胞的一个常染色体上编码腺苷酸脱氨酶（简称ADA）的基因（ada）发生
16、了突变。可以通过基因工程的方法治疗。,SCID患者生存在无菌环境中,基因治疗SCID的过程,2 ）基因工程与农牧业、食品工业,运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。,hyphal strands,small, young tree root,1 2N6愈伤诱导,2 N6-BA预培养,3 N6-H选择培养,优化的农杆菌介导法水稻遗传转化过程,4 植株再生,转基因牛,乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,转鱼抗寒基因的番茄,转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯,不会引起过敏的转基因大豆,利用转基因植物生产基因药物,转神经肽烟草 乙肝疫苗的西红柿 含霍乱疫苗的香蕉 含麻疹疫苗的莴苣,Transgenic Mouse,1982,Achievements of gene engineering,Transgenic plant,克隆羊
