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1、生物芯片 -寡核苷酸芯片 （Oligoribonucleotide Chip， Oligochip）,哈尔滨工业大学-生物芯片技术,田 丽 2014.09,哈佛大学的F.H.Westheimer教授说到：“后四十年的知识革命可能发生在生物学领域，今天如果有人对分子生物学一无所知，简直令人无法想象。” 今后几十年药物和农业的发展很大程度上依赖于分子生物学家对基因的操纵，这场革命将涉及到每个人的生活。,微阵列芯片,微阵列芯片主要是指采用光导原位合成或微量点样等技术，将大量生物分子如核酸片断、多肽片断、组织切片、细胞等有序地固定于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺、尼龙膜等）的表面，组成密集、有序的二
2、维分子阵列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效的检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。,2.1 脱氧核糖核酸DNA 2.2 DNA微阵列技术基础概念 2.3 生物芯片的载体材料 2.4 Oligochip芯片制作方法,OUTLINE,2.1 脱氧核糖核酸DNA,分子生物学,广义上讲：从分子的形式来研究生物现象的学科。 但是这个定义使分子生物学难以和生物化学区分开来。 从分子水平来研究基因结构和功能的学科。 直到1944年基因的化学成分才被发现。在此基础上才可能从分子的角度研究基因。,对象：生物体；
3、医学上主要为人体 特点：从分子水平上研究生物体的化学结构与功能的关系。 任务：了解与认识生物体内的化学反应及它与生命之间的关系，揭示生命的起源、廷续，发展的奥秘，从而控制与改造生命，为人类的健康、生产和生活服务。,分子生物学研究对象,DNA(Deoxyribonucleic acid)，中文译名为脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分。DNA是一种分子，可组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作。 基因（遗传因子）是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。 蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。
4、因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。 细胞是生命活动的基本单位，一切有机体（除病毒外）都由细胞构成，细胞是构成有机体的基本单位 。所具有的表现性是与其含有的蛋白质的结构与功能活性一致的,人类染色体组成,DNA空间结构,DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘。螺旋直径为2nm，形成大沟(major groove)及小沟(minor groove)相间。,DNA是生命的遗传物质，它由碳、氢、氧、氮和磷5种元素构成,方向相反 碱基配对规则 （A=T
5、 GC）,DNA 双螺旋结构模型,Watson-Crick碱基配对原理,1953年沃森(J.D.Watson)和克里克(F.H.C.Crick)共同提出DNA双螺旋结构模型。 沃森和克里克描述了自己的DNA模型：两条多核甘酸链形成一个右手的、反向平行的双螺旋结构；碱基位于双螺旋内侧而磷酸与糖基在外侧；以及碱基间的距离，核甘酸之间的夹角和碱基按A-T、G-C互补配对关系。 现在看上去好像很简单的一篇文章，当时它却像一只金手指，捅开了那层迷糊了科学界几十年的窗户纸，向人们描绘了DNA大体是什么样和怎么工作的，揭示了生命的一个大秘密。从那以后，一切似乎都变得很简单了；各种生物学上的突破接踵而至。,D
6、NA的组成,碱基利用嘧啶环上的N1、嘌呤环上N9与戊糖环1位上的碳原子形成糖苷键与戊糖相连。 碱基与糖的结合物称为核苷，如果再与一个磷酸脂基相连则形成核苷酸。 核苷酸是形成核酸所必要的。 核苷酸之间能够彼此相连形成一条糖基与磷酸脂基相间的核苷酸链。,一个核酸分子是由一系列化学键连接的亚单位序列构成。每一个亚单位包括一个含氮碱基（一个碳、氮杂环），一个异戊糖（环形五碳糖）和一个磷酸脂基团。,The double helix maintains a constant width because purines（嘌呤） always face pyrimidines（嘧啶） in the compl
7、ementary A-T and G-C base pairs. The sequence in the figure is T-A, C-G, A-T, G-C.,DNA is a double helix（螺旋）,X光衍射实验数据表明DNA是一种规则螺旋结构：每3.4nm旋转一周，直径约为2nm。 DNA密度测量说明这种螺旋结构应有两条链。这样如果两条链间的碱基都是朝里而且严格的按嘌呤对嘧啶排列，螺旋直径保持不变就很容易解释，否则，嘌呤对嘌呤则太粗，嘧啶对嘧啶则太细。 不论碱基数目多少，G的含量总是与C一样，而A与T 也是一样。因此通常以G+C的含量来描述DNA的组成。不同物种G+C的含量
8、一般在2674%。,Flat base pairs lie perpendicular to the sugar-phosphate backbone.,DNA is a double helix,双螺旋体类似于盘旋的楼梯：碱基对如同踏板。顺着螺旋，碱基一个堆一个。这种碱基对模型从两个方面维持着螺旋结构的热力学稳定性，即形成的碱基对之间以及相邻碱基对之间相互作用使体系的能量达到最低： 每对G-C键间的3对氢键和A-T间的2对氢键大大降低了体系能量。 碱基对间电子相互作用产生了疏水性碱基堆积作用；范德华力也是碱基间很重要的相互作用。 每个碱基对都受这两种力的影响，与其两侧的碱基对相互作用。,每个
9、碱基相对于其相邻的碱基对都绕螺旋轴旋转约36度。这样约10个碱基对就能旋转一周。双螺旋体中的两条链彼此环绕形成一条窄沟（约12nm宽）和一条宽沟（约22nm宽）。 双链是沿右手方向的，即顺时针方向转动所有这些都是B型DNA所具有的特征。,核苷酸,核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。,核苷酸-戊糖 （pentose）,酯键,糖苷键,戊 糖,核苷酸的碱基结构,嘌呤(purine) 分子式 C5H4N4,腺嘌呤(adenine, A),鸟嘌呤(guanine, G),碱基,嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine, C),尿嘧啶(uracil, U),胸腺嘧啶
10、(thymine, T),核苷酸的碱基结构,核苷：AR, GR, UR, CR 脱氧核苷：dAR, dGR, dTR, dCR,核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。,核酸,C,G,A,DNA空间结构,T,A,G,C,碱基互补配对,DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。,基因从结构上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。,DNA的变性,定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。,方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、 酰胺以及某些有
11、机溶剂如乙醇、丙酮等。,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,DNA复性,DNA复性(renaturation)的定义 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。,核酸分子杂交 在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子
12、间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,不同来源的DNA分子,DNA-DNA 杂交双链分子,核酸分子杂交的应用,研究DNA分子中某一种基因的位置 定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础,几种重要的酶,解旋酶：是一类解开氢键的酶，由水解ATP来供给能量；它们常常依赖于单链的存在，并能识别复制叉的单链结构。,几种重要的酶,基因的剪刀限制性内切酶（restriction Endonuclease）,限制性核酸内切酶:识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。 限制性内切酶是20世纪60年代末在细菌中发现的，能水解DNA分子骨
13、架的磷酸二酯键，使一个完整的DNA分子切成若干段； 每一种限制酶，都有自己特定的作用位点。,基因的剪刀限制性内切酶 （restriction Endonuclease）,限制酶主要存在于微生物中。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并能在特定的切点上切割DNA分子。 例如，从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间将这段序列切开。 目前已经发现了两百多种限制酶，它们的切点各不相同。,基因的针线DNA连接酶,连接酶旧称“合成酶”，是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须
14、是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键 DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的，最初是在大肠杆菌细胞中发现的。,基因的针线DNA连接酶,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫做黏性末端。 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割,然后让俩者的黏性末端黏合起来，似乎就可以合成重组的DNA分子了。但是，仅仅这样做是不够的，互补的碱基处虽然连接起来，但是这种连接只相当于把断成两截的梯子中间的踏板连接起来，两边的扶手的断口处还没有连接起来(如图)。要把扶手的断口
15、处连接起来，也就是把两条DNA末端之间的缝隙“缝合”起来，还要靠另一种极其重要的工具DNA连接酶,核苷酸是怎么连接的,3，5磷酸二酯键：核酸是由众多核苷酸聚合而成的多聚核苷酸（polynucleotide），相邻二个核苷酸之间的连接键即：3，5磷酸二酯键。 这种连接可理解为核苷酸糖基上的3位羟基与相邻5核苷酸的磷酸残基之间，以及核苷酸糖基上的5位羟基与相邻3核苷酸的磷酸残基之间形成的两个酯键。 多个核苷酸残基以这种方式连接而成的链式分子就是核酸。 无论是DNA还是，其基本结构都是如此，故又称DNA链或RNA链。,核酸链的简写式,核酸链的简写式：核酸分子的简写式是为了更简单明了的叙述高度复杂的核
16、酸分子而使用的一些简单表示式。它所要表示的主要内容是核酸链中的核苷酸（或碱基）。 二种常用的简写式： 字符式：书写一条多核苷酸链时，用英文大写字母缩写符号代表碱基，用小写英文字母P代表磷酸残基。核酸分子中的糖基、糖苷键和酯键等均省略不写，将碱基和磷酸相间排列即可。因省略了糖基，故不再注解“脱氧”与否，凡简写式中出现p就视为DNA链，出现则视为RNA链。以5和3表示链的末端及方向，分别置于简写式的左右二端。下面是分别代表DNA链和RNA链片段的二个简写式： 5ppppppppp3DNA 5p3 5ppppppppp3RNA 5p3 上述简写式的5末端均含有一个磷酸残基（与糖基的5位上的羟基相连）,3末端含有一个自由羟基（与糖基的3位相连）,若5端不写，则表示5末端为自由羟基。双链DNA分子的简写式多采用省略了磷酸残基的写
