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1、外周血细胞形态学检验及技巧 卫生部北京医院血液科 郑天林 卫生部临床检验中心 彭明婷 谷小林 陆红 一 血液学及血细胞形态学临床应用： 是临床血液病诊断与治疗及临床医学检验学的基础工作。 血细胞形态学适用于临床血液病诊断快速简捷的要求。 近年来由于血细胞学及超微结构、免疫学、细胞遗传学、融合基因、造血干细胞及其细胞因子、骨髓造血微环境、基质细胞、树突状细胞、淋巴系细胞发生及其疾病表现，细胞增殖动力学与细胞凋亡以及骨髓组织病理学应用，推动了血液的临床与实验室的新知识迅猛发展。 当前血液病不能单凭临床与形态学 作出 诊断，必须以临床和血细胞形态学为基础，将免疫学、细胞遗传学及分子生物学新知识、新技
2、术应用到血液学中，构成现代临床血液学与分子生物学诊断技术，弥补形态学的经验性与主观性带来负面缺陷，才能提高血液病的诊断与治疗水平。 进入 90 年代以来，国内外采用多学科联合技术综合诊断技术与方案： FAB-AL （ 1976 ）、 NCL （美国国家癌症研究所）对 FAB-AL 分型的补充 （ 1995 ）、 AL-MIC 分（类）型， MIC 及 MICM 分型（ 1985-1990 ）； FAB-CL 分型 （ 1989 ）、中国 CL 分型 （ 1997 ）； FAB-MDS 分型（ 1982 ）、 MIC 协作组对 FAB-MDS 分型提出补充建议（ 1987 ）； WHO 对造血系
3、统 及髓系恶性 疾病和淋巴系恶性肿瘤 WHO 分类 （ 2000 ）； 血细胞形态学诊断技术正在进入显微 图象 软件时期： 创造出许多多功能软件，如血细胞形态学、细胞化学染色、血液病诊断与鉴别诊断、 CL 诊断与治疗及教学系统多媒体软件等。 将显微镜与微机相连，应用储存、分类、检索软件，编辑、打印诊断报告，并可附多幅细胞 图象 。 二 血细胞形态学基本概念 血细胞形态学作为临床血液病基础诊断： 观察血细胞形态和数量及其比例的变化来研究造血器官的结构和功能是血液学的重要组成部分，是诊断造血系统疾病最基本、最简便实用的检查方法，被临床普遍应用。 正常人的血液及造血器官中，各种血细胞的数量有一定的正
4、常范围，不同血细胞及细胞发育的不同阶段有一定形态结构特点。 在造血系统疾病中，如果造血功能发生紊乱，就会从血细胞形态学的量变和质变中反映出来。 血细胞形态学检查应包括外周血和骨髓两部分组成，必须平行进行检查。因为，外周血的血细胞改变往往反映骨髓病变的信息，才有利于诊断。 三血细胞染色 （一） 细胞染色机制 ：染色是将细胞经染色剂的物理及化学作用，使 其清楚 显示细胞各个组成部分，有利辨识细胞形态。 染色可分二个步骤： 1 染料受相应物质吸附而附着于物质表面； 2 固着作用，即染色粒子进入细胞内起化学反应（染料透过细胞膜的学说很多，尚无定论），与相应的物质形成溶解度很低的盐固着于细胞内而显色。染
5、色剂皆有选择作用，其染色不是将细胞全部一齐着色，而只是将其中一部分染色，多余的被冲洗掉。目前多以吸附学说（电力吸附、机械吸附、化学吸附）来解释。 一般染色方法由两种染色剂（酸性、碱性）组成，通常细胞核及浆 碱性粒体为 碱性，细胞浆为酸性。酸性染料可和带正电荷的（碱性）物质结合，这种物质称嗜酸性物质，对酸性染料具有亲和力，因此嗜酸性粒细胞之颗粒本身为碱性物质；碱性染料可和带负电荷的（酸性）物质相结合，这种物质称嗜碱性物质，对碱性染色粒具有亲和力，因此嗜碱性粒细胞之颗粒本身为酸性物质。另一种蛋白质在 pH6.4 呈等电状态 ，本身所含的正 / 负电荷相等，因此，既能和酸性染料又能和碱性染料结合，这
6、种物质称中性物质，如中性粒细胞之颗粒。 一般用 pH6.4 PBS 来稀释染液，使每次染色都在同一 pH 中进行，让细胞在恒定条件下着色，使染色效果趋于一致。 作者：198585912005-5-27 19:51 回复此发言 - 2 外周血细胞形态学检验及技巧 染液过碱时，蛋白质带有负电荷，对 次甲蓝有色 部分的正电荷吸附力强，因此染成的细胞一般着色较蓝，说明 pH 不适合。 染色与固定亦有极大关系，因细胞 经固定 后，其蛋白质的电力吸附（电附）可能有变化，有些固定液能将细胞某部分的电附加强，使其染色更为容易。因此，这种固定剂不仅有固定作用， 也有媒染作用 （ Mordunt ），染色极为容易
7、。因此， 电附是 染色过程中最重要的作用。机械吸附在染色过程中也参与作用，如用苏木液和伊红染色，细胞核不是纯蓝色，蓝色中略有红色，胞浆也不能尽为红色，红色中略有蓝色或 两者皆带些 紫色。这是因为伊红与胞核 虽无电附仍有 机械吸附，故也能染上少量红色，苏木液与胞浆 虽无电附但也有 机械吸附，因而胞浆略显蓝色。化学吸附（作用）在染色中应用，最早应用于金属染色剂（氯化金、硝酸银等）的金属与细胞内物质起化学作用，使金属在细胞内变成沉淀物或死亡物，显示细胞结构或物质。近年来此原理用于细胞酶化学染色。 血细胞的染色多采用瑞氏染色和 姬姆萨 染色两种，但作者取其两种染色的优点，采用瑞氏和 姬姆萨 混合染色法
8、，比单用一种染色法更佳。但近年来也出现一些快速和改良染色方法及染色液商品化，对血细胞形态染色不一定适用。 （二）瑞氏（ Wright s staim ；美蓝伊红）染色： 1 瑞氏染料是由碱性染料美蓝（ Methvlem blue ）和酸性染料黄色伊红（ Eostm Y ）合称伊红美蓝 染料即瑞氏 （美蓝伊红）染料。 伊红钠盐的有色部分为阴离子，无色部分为阳离子，其有色部分为酸性，故称伊红为酸性染料。美蓝通常为氯盐是碱性的，美蓝的中间产物结晶为三氯化镁复盐，其有色部分为阳离子，无色部分为阴离子，恰与伊红钠盐相反。 2 用 甲醇作瑞氏 染料溶剂，即成瑞氏染液。甲醇是瑞氏染料良好溶剂，有两种作用：
9、（ 1 ）甲醇使瑞氏染料中美蓝（ M ）与伊红（ E ）在溶液中离解，可使细胞成分选择性吸附其中的有色物质而着色。 甲 醇 ME （瑞氏染料） M + + E - 在配制的瑞氏染液中美蓝如放置过久即可氧化而含有天青，美蓝天青与伊红化合物能使核染成紫红色，但不能使胞浆染为蓝色，多余 美蓝就可以 使胞浆染成蓝色，染色主要是化学作用，是离子彼此结合的反应。 （ 2 ）甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。 3. 瑞氏染液配制： (1) 瑞氏染液配制： 瑞氏染料 830gm 或 1g 甲醇（
10、 AR ） 500ml 或 600ml 先称干燥（事先放入温箱干燥过夜）瑞氏染料放置乳钵内， 用乳棒轻轻 敲碎染料成粉末，再行研磨至听不到 研芝麻声 即呈细粉末，加少许甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸内显“一面镜”光泽，而无染料粉粒沉着，再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮，静置片刻，将上层液体倒入 一 清洁储存瓶内（最好用甲醇空瓶），再加甲醇研磨，重复数次，直至乳钵内染料及甲醇用完为止，摇匀，密封瓶口，存室温暗处，储存愈久，则染料溶解、分解就越好，一般储存 3 个月以上为佳。 (2) 缓冲液： 1) 缓冲液作用：染色对氢离子浓度是十分敏感的，据观察 pH 值的改变，可使蛋白质与染料形成的化合物重新
11、离解。 缓冲液须保持 一定的 pH 使染色稳定， PBS 的 pH 一般在 6.46.8 ，偏碱性染料可与缓冲液中 酸基起 中和作用，偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用，使 pH 恒定。 2) 缓冲液配制（ pH6.46.8 ，弱酸性）： 配方 1 ： 配方 2 ： 1% KH 2 PO 4 30ml M/15 KH 2 PO 4 73.5 ml 1% Na 2 HPO 4 20ml M/15 Na 2 HPO 4 26.5ml 作者：198585912005-5-27 19:51 回复此发言 - 3 外周血细胞形态学检验及技巧 H 2 O( 新鲜 ) 加至 1000ml 置室温黑暗处，瓶
12、口密封，防止霉菌污染，如有污染则应报废。 （四）姬 姆萨 （ Giemsa s stain ；天青 - 伊红）染色 1 姬 姆萨染料是天青（蓝） 2 号伊红 AzurII Eqsin) 和天青（蓝） 2 号合成的。 2 姬 姆萨红染料（ Giemsa, 天青 - 伊红）染液配制： 姬 姆萨红染料（粉末） 0.5g 或 7.5g 甲醇（ AR ） 33ml 或 500ml 甘油（ AR ） 33ml 或 500ml 先将姬姆萨染料放入乳钵中，逐渐倒甘油研磨溶于甘油中，置于 56 水温箱内， 90 120 分钟，然后加入甲醇，摇匀后放置数天，过滤后或不过滤即可使用。此染液放置室温阴暗处，时间越长越
13、好。 使用染液 9 临时配置）： 姬 姆萨染液 1ml ，加 DDH 2 O10ml 混匀。即可使用。 3 染色步骤： （ 1 ）先用甲醇固定 2 3 分钟。 （ 2 ）将血或骨髓涂片放置 姬 姆萨使用液 15 30 分钟。 （ 3 ）涂片用自来水冲洗，在室温中干燥待查。 （五）瑞 氏及姬姆萨 染色液的鉴定：刚配好或放置一个月以上的染液可进行下列鉴定： 1 取 1 滴染液于乳白 玻 板上，自行迅速扩散开，其颜色变紫红色，且有伪足形成。 2 取 1 滴染液加 1 滴缓冲液，染液由深蓝 色立即 变为紫红色。 3 取血片或骨髓片 进行试染检查 ，观察染色后各类细胞的胞核、胞浆及颗粒着色情况， pH
14、是否合适及染色合适时间。如有上述变化，表明染液合格，可供使用。 （六）瑞氏染色 (Wright s)- 姬 姆萨（ Giemsa s ）混合染色： 瑞氏染色的染料配方浓度对细胞核着色程度适中 , 细胞核结构和色泽清晰艳丽 , 对核结构的识别较佳 , 但对胞浆着色偏酸 , 色泽偏红 , 对细胞浆内颗粒特别是嗜天青颗粒及嗜中性颗粒着色较差 , 而姬姆萨染色对胞浆着色能较好的显示胞浆的嗜碱性程度 , 特别对嗜天青、嗜酸性、嗜碱性颗粒着色较清晰 , 色泽纯正 , 而对胞核着色偏深 , 核结构显示较差 , 故采用以瑞氏染液为主 姬 姆萨染液为辅的混合染色。 染色步骤 : 1. 先用瑞氏染液将涂膜面充分覆盖； 2. 稍等片刻再加姬
