现代工业发酵调控学课件储炬发酵调控2复习

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1、2.代谢调节与代谢工程,微生物的代谢网络是受到高度调节,在1g（110-6 ml ）体积这么小的细胞里， E.Coli 20min复制一代，每个细胞含蛋白质分子数为1.7 106 每秒中要合成1400个蛋白质分子，如每个分子平均含有300个共价键，每秒要形成420，000个肽键。,微生物的代谢网络是受到高度调节,化学家合成第一个蛋白质花 了几个月的时间。 微生物如何协调其代谢活动的？ 生长迅速、高效是生存、竞争的需要。,微生物的代谢网络是受到高度调节,1)微生物生长在含有单一有机化合物为能源的合成培养基中，所有大分子单体(前体)，如氨基酸的合成速率同大分子，如蛋白质的合成速率是协调一致的。 2

2、)任何一种单体的的合成，如能从外源获得，只要它能进入细胞内，单体的合成自动中止。参与这些单体生成的酶的合成也会停止。,微生物的代谢网络是受到高度调节,3)微生物只有在某些有机基质，如乳糖存在时，才会合成异化这些基质的酶； 4)如存在两种有机基质，微生物会先合成那些能异化更易利用的基质的酶，待易利用的基质耗竭才开始诱导分解较难利用基质的酶； 5)养分影响生长速率，从而相应改变细胞大分子的组成，如RNA的含量,微生物的代谢网络是受到高度调节,微生物具有很强的适应环境变化的能力。它可以通过调整其代谢机能来响应环境的变化。如给予细菌不同的养分，细胞的大分子组成会起相应的变化。 例如，改变培养基的成分，

3、维持培养温度不变，可以改变鼠伤寒杆菌的生长速率，用倍增或世代时间来表示其生长速率，见表3-1。,微生物的代谢网络是受到高度调节,代谢控制机制,分为两种主要类型： 酶活的调节(活化或钝化) 酶合成的调节(诱导或阻遏)。,代谢控制机制,微生物大致采用3种方式调节其初级代谢： 酶活性的调节 酶合成的调节 遗传控制,调节的生化基础,微生物调节的位点 有许多位点可以控制外来化合物的代谢 原核生物与真核生物有所区别,代谢调节的部位,微生物的代谢调节主要通过养分的吸收、排泄，限制基质与酶的接近和控制代谢流等几个部位实现的，见图3-1。 在这方面真核生物与原核生物略有区别，主要表现在前者有各种各样的细胞器。,

4、代谢调节的部位,1) 养分吸收分泌的通道 大多数亲水分子难于透过细胞膜，需借助一些负责运输的酶系统，如透酶才得以实现，有些运输反应是需能的。 2) 限制基质与酶的接近 在真核生物中各种代谢库的基质分别存在于由胞膜分隔的细胞器内。例如，在链孢霉中精氨酸存在于细胞质和液泡内。这两处参与精氨酸代谢的酶量有很大的差别。原核生物的控制方式不同，其中有些酶是以多酶复合物或以细胞膜结合的方式存在，类似于酶的固定化形式，使它不能自由活动。,代谢调节的部位,3) 代谢途径通量的控制 微生物控制代谢物流的方法有两种：调节现有酶的量，这可通过增加或减少途径中有关酶的合成或降解速率实现；改变已有酶分子的活性。,微生物

5、调节的位点,酶活性的调节方式,微生物代谢调节是通过小分子化合物进行的。这些小分子化合物存在于细胞内，由细胞产生，通过它们调节酶反应速率，激活或抑制关键酶，有效地控制各种代谢过程。 酶活性的调节可归纳为共价修饰、变(别)构效应、缔合与离解和竞争性抑制，以及基因表达。 下面着重介绍前两种方式。,共价修饰,指蛋白质分子中的一个或多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或解开，使其活性改变的作用。 用共价修饰方式可使酶钝化或活化。 从蛋白质中除去或加入的小化学基团可以是磷酸基，甲基，乙基，腺苷酰基。 蛋白质的共价结合部位一般为丝氨酸残基的-CH2OH。,共价修饰,共价修饰作用可分为： 可逆共价修饰 不可逆共

6、价修饰,可逆共价修饰,细胞中有些酶存在活性和非活性两种状态，它们可以通过另一种酶的催化作共价修饰而互相转换。,可逆共价修饰,例如，磷酸化酶是通过激酶或磷酸酯酶来调节其活性的，见图3-2。糖原合成酶的活性也是以这种方式调节的。,可逆共价修饰,可逆共价修饰,酶的可逆共价修饰作用的意义在于： 1)可在短时间内改变酶的活性，有效地控制细胞的生理代谢； 2)这种作用更易为响应环境变化而控制酶的活性。,不可逆共价修饰,典型的例子是酶原激活。这是无活性的酶原被相应的蛋白酶作用，切去一小段肽链而被激活。 酶原变为酶是不可逆的。 胰蛋白酶原的活化靠从N-端除去一个己肽(Val-Asp- Asp- Asp- As

7、p-lys)。 胰蛋白酶原活化是信号放大的一个典型例子，见图3-3。,不可逆共价修饰,不可逆共价修饰,少量的肠肽酶便可激发大量的胰蛋白酶原转变成胰蛋白酶。 这是因为胰蛋白酶能催化其自身的活化。一旦这些胰酶完成了其使命后，便被降解而不能再恢复为酶原。 这种酶活性的关闭作用是极其重要的。,缔合与解离,能进行这种转变的蛋白质由多个亚基组成。蛋白质活化与钝化是通过组成它的亚单位的缔合与解离实现的。这类互相转变有时是由共价修饰或由若干配基的缔合启动的 。,缔合与解离(Association and dissociation),竞争性抑制,一些蛋白质的生物活性受代谢物的竞争性抑制。 例如，需要氧化性NAD

8、+的反应可能被还原性NADH的竞争性抑制；需ATP的反应可能受ADP或AMP的竞争性抑制；一些酶受反应过程常受产物的竞争性抑制。,变构效应（allosteric effect）,每一个学科都它的某些重大发现而推动它前进。对现代生化来说，一个重要的发现是由副位效应引起的蛋白质活化与钝化状态的相互转变。这或许是一种主要类型的生物控制机制，这一现象称为变构理论，所产生的作用称为变构理论，所产生的作用称为变构效应。,变(别)构控制,变构或别构(allosterism)效应又称为副位效应: 是指一种小分子物质与一种蛋白质分子发生可逆的相互作用，导致这种蛋白质的构象发生改变，从而改变这种蛋白质与第三种分子

9、的相互作用。,变(别)构控制,变构蛋白质是表现变构效应的蛋白质，具有变构作用的酶称为变构酶。 效应物：引起变构效应的小分子物质。,变构效应的由来,变构效应是Gerhart与Pardee于1962年研究胞苷三磷酸(CTP)对其自身合成的反馈抑制作用时发现的。,变构效应的由来,Aspartate transcarbamylase(ATCase) 天冬氨酸转氨甲酰酶,变构效应的由来,变构效应的由来,CTP反馈抑制其生物合成途径的头一个酶，天冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase)。CTP主要用RNA与DNA的合成。 变构效应的第一个迹象是从米氏动力学研究中发现的。,变构效应的由来,变构酶的基质与反应速率的关

10、系曲线与一般的酶有些不一样。 维持氨甲酰磷酸浓度过量，改变天冬氨酸浓度，测定基质浓度对ATCase的反应初速率，V0的影响，所得曲线非典型的双曲线型，而是近S型。,变构效应的解释,变构效应的由来,即在低的基质浓度下，V0随基质浓度的增加而缓慢上升，随后，在高基质浓度下V0的增长加快，然后又慢下来，直到一最大值Vmax。这种S型曲线现已被当作变构酶的动力学特性。,变构效应的由来,第二个迹象是：在CTP存在下作同样的动力学测量，得到同样S型曲线，只是更接近S型。从米-孟动力学曲线可见，比较不加与加有终产物CTP的系统，显然像竞争性抑制作用。,变构效应的由来,变构效应的由来,因CTP的存在并未改变V

11、max值而使Km值增加50，见图3-9。这难于解释为什么CTP能起竞争性抑制作用，因其结构与天冬氨酸根本不同。这说明除了竞争性与非竞争性外还存在其它什么原因。,变构效应的解释,变构现象可用酶分子上具有多个不同的结合位点来解释。一个位点结合通常的基质，天冬氨酸与氨甲酰磷酸(活性中心)；另一个位点选择性地结合效应物，CTP。,变构效应的解释,问题的焦点是，天冬氨酸与CTP的结合位点是不是分立的。如果设法消除CTP的结合位点而仍能保留ATCase的活性，这证明这种说法是对的；否则，说明它们之间是各自独立的。,变构效应的解释,用温和加热或对-氯汞苯甲酸作变性处理可以证实这一说法。试验结果示于图3-10

12、。,变构酶的典型动力学曲线,变构效应的解释,比较曲线A与B可见，经热处理过的酶，加CTP与不加CTP的曲线的形状很相似，都失去S型性质。 这说明CTP的结合位点被消除，加CTP不起作用，而活性位点仍起作用。 由此证明，两个位点的观点是正确的，抑制位点可被选择性地破坏。,变构效应的解释,用其它变性剂，如对-氯汞苯甲酸处理，也得同样的结果。 比较曲线A与C可以看出，两个位点间存在相互作用，因经热处理后曲线失去S型性质，而变成双曲线型，酶反应速率增加。,变构效应的解释,在反应系统中加ATP会影响ATCase 的酶活。加ATP的曲线几乎恢复到典型的双曲线型，其Km值减小，说明基质协同作用的需要减小。鉴

13、于CTP与ATP的结构相近，有人认为，这两种效应物结合在同一位点上。,变构效应的解释,故ATCase是一种能在同一位点上结合两种效应物的的变构酶，得到怎样的结果(也可能是完全相反的)取决于所结合的物质。这不是ATCase所独有的例子，但也不是所有的变构酶都是这样的。,变构调节的特征,1、天冬氨酸转氨甲酰酶是有代表性的一类酶，它们具有一个以上的结合位点。除了主要的结合天然基质的活性位点外，也在同一分子内存在着分开的第二个（副）位点，它能结合其他一些起抑制剂或活化剂作用的物质。 2、主要位点和副位点均可被同时占据。,变构调节的特征,3、副位点的作用不一定是专一性的，可以结合不同的物质，产生不同的效

14、应。 4、副位点的结合可能引起随后在蛋白质分子构象的变化，从而影响主要活性部位的催化活力。 5、副位点效应构成反馈抑制机制的基础，这种反馈机制是调节代谢的有效方法。,协同作用,所谓协同作用是指酶蛋白分子的一个位点与配基的结合会影响同一分子的另一位点与基质的结合。 如一蛋白质分子含有能与同一配基结合的两个位点，在一位点上的结合不影响另一位点的结合作用。这些位点各自为政，互不干涉。（无协同作用）,协同作用,若起始的配基结合促进分子的另一位置的更多的基质的结合，便认定这种蛋白质具有正向协同作用。 若这种结合使进一步结合受阻，便称为负向协同作用。,协同作用,蛋白质结合配基的协同作用可用以下的一些数学方

15、程描述。 蛋白质(P)同一个基质(L)(常称为配基或配体，ligand)结合，在蛋白质分子上P与L之间的相互作用位置称为结合位点。,协同作用,有些蛋白质分子含有一个以上的结合位点。若一蛋白质分子含有n个结合位点，它能结合n个配基，这种结合可用下式表达：,协同作用,P nL PLn 其中n = 1, 2, 3 , 此式可改为： KPLn/PL n (3-1) 式中K是平衡常数或缔合常数。,协同作用,生化研究工作者感兴趣的是 ： 1)每个蛋白分子结合位点的数目，即n值 2)结合的强度，即K值； 3)结合的特异性(专一性)； 4)如存在两个以上的结合位置，它们之间是否相互作用。,协同作用,有几种方法

16、可精确测定这种结合，即在不同的配基浓度下测定蛋白质被配基饱和的程度()。 符号表示结合配基的浓度Lb与总蛋白质浓度Pt之比： Lb/Pt,协同作用,式中的限值为0n， 如=0，表示无配基结合； 如= n，表示配基的结合量达最大，这时 的蛋白质已被配基完全，即100%饱和； 如=0.5 n，这表示50，或半饱和。与配基浓度间的关系可用式3-2表示：,协同作用,nKLC/(1KLC) （3-2） 式中c与n有关，是结合位点之间相互作用的度量。 用膜超滤技术可测量。方法如图3-4所示：,用膜超滤技术可测量,协同作用,L b (被结合的L)LC (初始的L)LY (游离的L) L b/PZ 式中PZ蛋白质总量。超滤膜的孔径能让配基通过，蛋白质留下。,协同作用,可用放射性标记的配基做试验。维持PZ不变，测定不同的LC ，得相应的值。以对L作曲线，得一双曲线或似S型的曲线。双曲线表示仅有一个结合位点或一个以上的互不相干的位点。,协同作用