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1、发酵调控学,生物工程学院 储 炬,课程内容,1 微生物生长分化调节的规律 (1)细胞周期内有关生长的活动，DNA合成与细胞分裂的调节 (2)丝状菌生长分化的调节 2 初级代谢的调节机制 (1)调节的生化基础 (2)代谢调节的方式与内容：诱导、分解代谢物调节、反馈调节,课程内容,3 次级代谢物的生物合成的调节 (1)次级代谢物的概念 (2)生物合成的前体 (3)次级代谢物的生物合成 (4)抗生素生物合成的控制,课程内容,4 发酵过程控制 (1)控制的策略 (2)参数的指导作用 (3)参数相关分析 (4)过程控制的评价,主要参考书,现代工业发酵调控学，储炬，李友荣，化学工业出版社，北京。2002年
2、1月 Biotechnology, 2nd ed. Vol.1; Biological Fundamentals. Rehm H-JB Biotechnology, 3nd ed Vol.3;Bioprocessing. Rehm H-JB,微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术,代谢调控是研究内在的调节机制，而过程优化则是外在控制，是建立在相关参数的分析上的，这两个方向相辅相成，前者为后者的基础，而后者是使理论变为现实的手段。,1微生物生长与调节,为了控制菌体的生长，需要了解生长的方式，细胞分裂和调节的规律，测量微生物生长的各种办法，微生物生长繁殖的形式与工业生产的关系，环境变化对微生物生长的
3、影响。因此，研究微生物的生长分化规律无疑是发酵调控原理的一个重要组成部分。,细胞周期,对于个体细胞行为，主要关心 染色体启动、复制和分离 新细胞壁材料的合成与插入 协调染色体复制和细胞分裂的信号,细胞周期,细胞周期(Cell cycle)： 细胞的一系列可鉴别的周而复始的生长活动。这些活动的顺序不变, 完成一个活动后才能进行下一个活动。,图1 细胞周期,细胞周期,典型的真核生物细胞周期如图所示: S, M和G1, G2分别代表DNA 合成, 有丝分裂期和两次间隙。 若生长速率因养分多寡而改变, S, G2 和M 几乎不变, 只有G1改变。 MTG: mean generation time,细
4、胞周期,原核生物在低生长速率下的细胞周期, 与真核生物相似。 其染色体复制期C 相当于 S； 细胞分裂期 D相当于G2+M； C 和D 不随生长速率变化, 只有G1可变动。细胞周期的各项活动怎样去适应生长速率变化的需要？,染色体复制与细胞分裂的调节,染色体复制怎样与细胞分裂协调？ 在高速生长下, 如细胞周期为30 min, 染色体复制不能在一个周期内完成。 为此，未等前一轮复制结束，后一轮复制又在原点上启动。 可以把C 期的启动和终止,以及细胞分裂看作是不可更改的活动顺序, 称为C+D 周期。,染色体复制与细胞分裂的调节,若增代时间少于 C+D时间, C+D 周期重叠，其重要特征是分配到子细胞
5、的染色体已开始新的一轮复制。这类染色体称为二叉染色体(dichotomous)。,图2大肠杆菌的染色体复制和细胞分裂的时间分配示意图,染色体复制和细胞分裂的调节规律,染色体复制未完成， 细胞就不会分裂。不管生长速率如何，大肠杆菌的细胞分裂总是出现在染色体复制完成之后。 不管生长速率如何，C 和D 所需时间大致不变。 C 和 D可以依次或同时(指上一轮的 D和下一轮的C ) 进行。,思考题,加倍时间最小为多少？C40， D20时，时间如何分配？,染色体复制的启动,染色体复制的启动受启动因子(origin), 一种特异调节性蛋白的正向控制。当启动因子增加到某一临界水平, 启动便开始。在这以后启动因
6、子被毁或稀释。合成启动因子达到有效浓度所需的时间恰好等于培养物增代时间。,染色体复制的启动,大肠杆菌在启动时的启动因子数量与细胞质量之比在各种生长速率下是一样的。这一比例实际上是染色体启动因子的浓度。细胞似乎能检出启动因子的浓度。当它达到一临界值时便启动新一轮的复制。启动的直接后果是启动因子的浓度提高一倍。,染色体复制的启动,启动不会重新发生直到其浓度因生长而降到临界值。这种控制机制构成一种生物钟。它是以细胞体积或其它有关参数为依据。据此，染色体复制的启动频率是DNA 合成速率的控制步骤。,染色体复制的启动,O/M=I 启动， 启动后，2O/M=I, II 不再启动， M增加，M 2M，使I逐
7、渐下降， 2O/2M=O/M=I， 又开始启动。,启动和复制是性质截然不同的两种过程,启动的过程需要蛋白质合成，如蛋白质合成受阻，已启动的DNA合成能完成，但不能启动新一轮DNA合成 。 曾检出其产物负责启动而不负责随后复制的基因； 加入利福平或氯霉素抑制RNA或蛋白质合成或除去营养缺陷型所需的氨基酸都能阻止启动，但允许复制继续完成； 培养物进入稳定生长期后，中止生长的细胞含有完整的染色体。,染色体复制的启动,启动总是在染色体上的专一位置上进行。此位点称为复制或染色体原点。在大肠杆菌此位点很靠近ilv座位。 在大肠杆菌和枯草杆菌中复制叉以两个方向沿染色体运行，大约在离原点180度地方相遇。,染
8、色体复制的启动,启动的频率取决于细胞量增长的速率，即生长停止，启动也随着停止是预料中的事。,细胞周期的研究方法,1 镜检法 用电子显微镜观察单个细胞的生长，定时拍照。由此发现大肠杆菌在分裂时细胞个子的变化不大。,细胞周期的研究方法,1 镜检法 说明似乎存在一种控制细胞个子大小的因子，即尺寸因子(size factor), 可能是启动细胞质量(initiation mass)。,1 镜检法,缺点:细胞由培养液转移到固体表面,会受到干扰。 细胞年龄变化较大时,细胞大小变化不大。,2 同步培养(Synchrony)法,(1) 密度梯度离心沉降法 按细胞的大小/年龄把在对数生长期的培养物分级。 H2O
9、/D2O密度梯度沉降法: 能应用于任何品种, 不会施加渗透压强 的影响。 从某一密度带便可分离出同质的细胞群体，随后培养。,细胞大小的分布频率与蛋白质合成速率的关系,细胞大小的分布频率与蛋白质合成速率的关系,蛋白质合成速率与细胞长度(体积)成正比，从而与细胞年龄成正比。,(2)过滤洗脱法,将细胞粘附在固体支持物，如硝化纤维膜上，然后将其倒置，让生长培养基从上到下通过，新生的细胞便被洗脱到培养基中，呈一种特征性的振荡模式，见图123。,过滤洗脱法,(2)过滤洗脱法,在初始冲洗(wash-off)期后从滤膜上洗脱下来的主要是新分裂的细胞。在洗脱曲线高峰下从膜上洗下的细胞是沉积在膜上的新生细胞后代，
10、那些在低峰下的是其沉积时正要分裂细胞后代。,过滤洗脱法,洗脱(wash- off)的振荡模式可以测出细胞周期。,3 同位素示踪法,如亲本培养物沉积在滤膜上之前用氚标记的胸苷使细胞带上标记，则结合到洗脱细胞的标记量与结合到亲本培养物那一年龄细胞的标记量成正比。,细胞周期,细胞周期,其一个洗脱峰(后代)带有比前一代少一倍的放射性标记。 可以分别求得C和D值,3 同位素示踪法,另一种研究细胞周期的方法是通过蔗糖密度梯度离心，使一对数生长的培养物沉淀, 收集最上层的细胞，在含有氚-标记胸苷的生长培养基上生长，测量其DNA合成速率。,3 同位素示踪法,洗脱前在无标记培养基中生长，洗脱时用带标记的培养基，
11、得到的带标记DNA呈阶梯上升状。,细胞周期,4 生长速率与细胞个子大小的关系,生长培养基越丰富，细菌生长速率加快，其细胞的个子也越大。 如在同一种培养基内改变温度也会影响生长速率，但对细胞个子大小几乎没有多大影响。,4 生长速率与细胞个子大小的关系,如一细胞的增代时间为60min，在细胞分裂时染色体复制便开始启动。假设细胞这时具有质量为M (启动细胞量=1/启动因子浓度)。,4 生长速率与细胞个子大小的关系,个体细胞的量在指数地增加，直到2M，细胞便开始分裂。 此时从培养液中检出新生的细胞，置于较丰富的培养基 (能使菌快速生长, 增代时间为35 min) 中，并假定细胞迅速调整到新的生长速率。
12、,4 生长速率与细胞个子大小的关系,这样，个体细胞量增长速率往上移动，如C+D规律还适用，下一个细胞分裂的时间不会变动，但细胞个子会增大。 新一轮复制的启动将在细胞分裂前便开始。,4 生长速率与细胞个子大小的关系,换句话说，C+D 周期现在开始重叠。快速生长经一个细胞周期后便达到新的平衡。生长速率越快，细胞个子的差异也越大。,生长速率对细胞个子和染色体复制启动时间的影响,生长速率对细胞个子和染色体复制启动时间的影响,可用式1-27 表示细胞周期t对指数培养物的细胞个子平均大小M 的影响。 M = K2(C+D/t) (1-27) 曲线的形状将取决于C，D 和K 是否变，只有在简单情况下logM
13、与t作曲线才会得一直线。,细菌培养物的生长周期,在一来自静止期细胞的培养物的生长期间，在细胞数目开始增加以前有一相当长的停滞期。细胞量开始增长的滞后现象短一些。,细菌培养物的生长周期,如达到物态的指数生长，则所有可测的参数也将平行地增长。 当培养物进入静止期便发生与上述相反的活动顺序。 因启动速率比细胞分裂早减速CD分钟。 细胞量增长下降时，细胞分裂继续指数进行，细胞渐渐变小。,细菌培养物的生长周期,细菌培养物的生长周期,新的一轮DNA复制的启动频率取决于新细胞量的积累速率，则吸光度与细胞数目至少有CD分钟不平行。,生长速率和DNA浓度,细胞中的DNA%随生长速率的增加而下降，可用式1-28表
14、示: G/M=/(KC ln2)(1-2-C/) (1-28) 式中G 是基因组的当量，为每个细胞的DNA 平均值。,生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响,展示了3种质量倍增时间： a) 70 min， b) 40 min， c) 20 min,生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响,一个启动细胞量单位含有一个刚开始一轮复制的染色体。用一水平线C 分钟长度表示。它在纵轴上所处高度代表细胞量。假定细胞量的复制时间为70 min，见图1-28a，将出现轮与轮复制的间隙。当细胞量增加到三倍时它将完成4 个复制好的染色体。,生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响,如在零小时把细胞置于增代
15、时间为40 min的培养基内，见图1-28b，则新一轮复制将紧跟在上一轮复制完成之后开始，轮与轮之间不存在间隙。待细胞量增到3个单位时，第二轮的复制将不会完成。结果得到2条复制了一半的染色体，DNA浓度下降到3/3。,生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响,如将细胞置于增代时间为20 min的培养基内, 在第一轮复制还未完成前第二轮复制已开始。当细胞量达到3 时, 只有一个带三个复制叉的染色体，见图1-28c，DNA 浓度进一步下降到2.25/3。,生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响,生长速率影响染色体上不同位置的相对基因拷贝数,在一随机的指数培养物中，接近原点处的基因，其拷贝数总
16、是居多，靠近两端的较少。 这种相对基因剂量的倾斜度随生长速率的增加而提高。,生长速率影响染色体上不同位置的相对基因拷贝数,DNA的浓度随生长速率的增加而下跌，从而不同程度地影响基因浓度。那些靠近染色体原点的基因浓度没有变化；位于中间的基因平均浓度则只有原点周围的一半左右；处在染色体复制近末端的基因浓度最低。,生长速率影响染色体上不同位置的相对基因拷贝数,在一个细胞周期内，一个基因浓度相对另一个而言，可相差4倍。生长速率对不同作用，提供了一种解释非随机基因次序的理由。,生长速率影响染色体上不同位置的相对基因拷贝数,据此，对生长速率有限制作用的应位于靠近染色体原点处。其实，这是为什么大肠杆菌中有6 个拷贝编码核糖体RNA的基因都聚集在原点的附近的缘故。,生长速率对细胞组分的影响,每个细胞RNA随生长速率的变化可以达10倍之多。在快速生长的细胞中RNA的含量可以达到细胞重量的30。 每个细胞的DNA也随生长速率的提高而增加，但程度低一些。因此，以细胞重量衡量，DNA含量是减少的。 细胞的外壳的厚度通常不变，胞壁和质膜在整个细
