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1、生物大分子的分离与提取,主讲人：韩庆典 Tel: 13869906351 QQ:869657998 临沂大学生命科学学院,课程主要讲述内容,第一章 绪论 第二章 发酵液预处理与固液分离 第三章 细胞破碎与分离 第四章 细胞碎片与包含体的分离 第五章 沉淀分离,第六章 膜分离技术及应用 第七章 萃取 第八章 吸附和离子交换 第九章 色层分离法 第十章 电泳 第十一章 结晶,教材及参考资料,欧阳平凯、胡永红. 生物分离原理与技术，化学工业出版社，1999 孙彦. 生物分离工程. 化学工业出版社，2005(第二版） 严希康. 生化分离工程. 化学工业出版社，2001 刘国诠. 生物工程下游技术（第
2、二版）. 化学工业出版社，2003 毛忠贵. 生物工业下游技术. 中国轻工业出版社，1999 刘茉娥. 膜分离技术. 化学工业出版社，2000 张镜澄. 超临界流体萃取. 化学工业出版社，2000,国内杂志,膜科学与技术 化工进展 生物工程学报 现代化工 化工学报 高校化学工程学报 化学工程 CHIN J CHEM ENG 离子交换与吸附 化学工业与工程 Science in China B; Science in China A; Chinese Science Bulletin; Prog Nat Sci。,刊源： 1) 分离分析期刊：Bioassay; Anal. Chem.; Sepa
3、r. Purif Method; Electrophoresis; Adv. Chromatogr; J Chromatogr A; LC GC-Mag Sep Sci; J Chromatogr B。 2)综合性期刊：Nature; Science; Proc. Natl. Acad. Sci. USA。 3)生物工程类期刊：Cancer Gene Ther; Bio-Technol; Appl Environ Microb; Yeast; Curr Opin Biotech; Biotechnol Bioeng。,何为生物大分子?,概念：指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或
4、更多的有机分子。主要指蛋白质、核酸以及高相对分子量的碳氢化合物。 氨基酸、脂肪酸等都叫做生物单分子，是构成大分子的基本物质。,生物技术(Biotechnology)应用生命科学研究成果，以人们意志设计，对生物或生物成分进行改造和利用以改善人类生存环境的技术。 现代生物技术综合分子生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、胚胎学、免疫学、化学、物理学、信息学、计算机等多学科技术，可用于研究生命活动的规律和提供产品为社会服务等。,1.1 生物技术与生物分离,生物分离技术,概念：从动植物与微生物的有机体或器官、生物工程产物（发酵液、培养液）及生物化学产品中提取、分离、纯化有用物质的技术过程。也常称为生物
5、分离工程技术、生物工程下游技术。,生物分离工程：为提取生物产品时所需的原理、方法、技术及相关硬件设备的总称，指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程 (Downstream Processing)。 生物技术下游加工过程 目标产物的分离纯化过程 生物加工过程： 生物技术上游加工过程：优良生物物种的选育、基因工程、细胞工程、生物反应过程（酶反应、微生物发酵、动植物细胞培养等)。 单元操作： 完成一道工序所需的一种方法和手段。,生物技术的目标就是指利用培养微生物、动物细胞、植物细胞来生产对人有用的产品。,生物技术树,生物技术产业 （基因工程
6、药物，农业新品种，生物农药，化肥，化工原料，食品等等）,资金，市场，管理,生物技术 （基因工程、细胞工程、蛋白质/酶工程、发酵工程、生物化学工程）,生命科学 （生物化学，微生物学，遗传学，免疫学，细胞学、分子生物学、生理学）,基础科学 （生物学、化学、物理学、信息学）,生物科学与生物技术及其产业的关系,生物技术多学科性,美国生物技术产品销售,美国工业化生物技术研究与发展基金分布图,生物技术分类,Genic Engineering Cell Engineering Enzyme Engineering Fermentation Engineering Protein Engineering Bi
7、ochemical Engineering,生物技术发展阶段,重要的现代生物技术仪器与设备,生物技术的最新进展,(1) 基因工程方面 试管婴儿、细胞融合、蛋白质序列分析、转基因、克隆 (2) 生物反应器 连续式，柱式、固定化酶、固定化细胞反应器 (3) 发酵技术 如：固定化酶、固定化细胞技术,获得产品的有效途径,Raw materials 原材料 Pretreatments 预处理 Bioreactions 生物反应 Bioseparations 生物分离 Products 产物,生物下游加工在生物技术中的地位及特点,1) 生化产品的必经的过程。 2) 回收率不高。抗生素(80%左右)，蛋白质
8、(60-90%)。 3) 分离纯化昂贵。下游研究费用占整个费用的50%以上；产品的成本构成中分离纯化的成本占全部成本的40-80%; 精细和药用产品的成本比率更高; 大多数酶70%。 4) 基因工程的费用。下游占50-80%。基因工程表达产品成本占85-90%；劳动力和物力成本占整个劳动力的70-90%。 5) 中药现代化的重要技术平台。农学、分离科学、生化分析、药学等。 6) 提供产品竞争力的关键技术之一。WTO，降低生产成本、提高产品标准。 7) 环境污染的治理（慢性铅中毒）。,1 按用途分类 食品类 保健品类 医用类产品 农业用产品 生物试剂类、抗生素等 2 按分子量大小分类 Mass
9、1000D：酶、抗原、抗体、多肽、蛋白质类 3 按发酵时目的产物所在的位置分类 cell内：胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质 cell外：抗生素（青霉素、红霉素）、胞外酶（-淀粉酶）等,1.2 生物物质与生物分离,生化产品的特点,1)应用面广。医药卫生、环保、动植物生长调节、食品和试剂等 2)种类繁多。分子量X0X000000，结构功能复杂，生物活性各异。 3)目的产物在初始物料中的含量低。青霉素(4.2%)、庆大霉素(0.2%)、干扰素(50ug/ml)。 4)初始物料成分复杂。除少量产物外，还有大量的细胞及碎片、其他代谢物（几百上千种）、培养基成分、无机盐等。 5)生物活性物质的稳定
10、性低。易变质、易失活、易变性，对温度、pH值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感。 6)产品的质量要求高，尤其是药品等。成品青霉素对其强致敏原 -青霉噻唑蛋白必须控制RIA值(放射免疫测定)小于100(1.5*10-6)，蛋白类药物(杂质2%)、重组胰岛素(Humulin)中杂蛋白小于0.01%。,生物分离的流程与单元操作, 细胞回收技术: 絮凝，离心，过滤，微过滤。 细胞破碎技术: 球磨，高压匀浆，化学破碎技术 初步纯化技术: 吸附，离子交换，沉淀（盐析 法，有机溶剂沉淀，等电点，沉淀剂），溶剂萃 取，两水相萃取，超临界萃取，逆胶束萃取，膜 分离技术 高度纯化技术: 各类层析，
11、亲和，聚焦，离 子交换，结晶 成品加工：浓缩，除菌与热原，喷雾干燥，气流干 燥，沸腾干燥，冷冻干燥,1.3 生物分离过程的特点,A. 生物工程的主要特点是生物制品多种多样，产品的多样性导致分离方法的多样性,Types of molecules manufactured by fermentation,还可以增加胰岛素、生长激素、干扰素等基因工程产品,B. 绝大多数生物分离方法来源于化学品的分离方法 大约80%的化工分离方法可应用于生物分离技术中,用于生物技术的分离方法类型,C. 生物分离一般比化工分离难度大 1.成分复杂: 固体成分包括完整有机体、培养基及底物中的不溶物 液体成分包括底物可溶物
12、、代谢中产物及目标产物。 2.悬液中的目标产物浓度低： 获得高纯度的干燥产品，需要几步； 分离过程精细，成本高；,D.生物产品要求高质量： *purity（纯度） *sanitation（卫生） *biological activity（生物活性） 分离过程的成本占产品总投资的大部分， 因此必须仔细考虑和设计产品的回收和纯化过程,生物分离的流程与单元操作,生物分离具有许多相似的单元操作 生物分离一般分四步 A. Removal of insolubles(3 unit operations) （不溶物的去除） *filtration（过滤） *centrifugation（离心） *cell
13、disruption （细胞破碎） （产物浓度和质量得到了提高）,B. Isolation of products（产物分离） adsorption - ion-exchang（离子交换吸附） extraction（萃取） a. solvent extraction（溶剂萃取） b. reversed micelle extraction（反微团萃取） c. supercritical fluid extraction（超临界流体萃取） d. two-aqueous phase extraction（双水相萃取） （以上分离过程不具备特异性，只是进行初分） （可提高产物浓度和质量）,C. Pu
14、rification of products（产品的纯化） *chromatography（色谱） *electrophoresis（电泳） *precipitation （沉淀） （以上技术具有产物的高选择性和杂质的去除性）,D. Polishing （产品的精制） *crystallization（结晶） *drying （干燥）,物理性质 力学性质：重力、离心力、筛分； 热力学性质：状态变化、相平衡； 传质性质：扩散； 电磁性质：磁化；,1.4、生物分离技术和原理,2）化学性质,化学热力学：化学平衡； 化学反应动力学：反应速率； 化学解离性质：极化、离子化,3）生物学性质,生物分子识别：
15、生物亲和作用； 生物输送性质：生物膜输送； 生物反应、控制：酶反应、免疫系统。,生物分离过程的一般流程,生物分离操作及其分离机理,设计中应考虑下列问题,1. What is the value of the product? （产品价值） 2. What is an acceptable product quality? (产品质量） 3. Where is the product in each process stream? （产物在生产过程中出现的位置） 4. Where are the impurities in each process stream?（杂质在生产过程中出现的位置）
16、5. What are the unusual physicochemical properties of the product and the principal impurities? （主要杂质独特的物化性质是什么？） 6. What are the economics of various alternative separations? （不同分离方法的技术经济比较）,方法选择的基本原则,设计前应了解的信息,1）在设计前，首先要掌握的产物物化性质，主要包括： (1)溶解度及影响因素，包括温度、pH值、有机溶剂和盐等； (2)分子量和分子形状。对于高分子物质非常有意义； (3)沸点和蒸汽压。对于热稳定的小分子物质非常有意义； (4)极性大小； (5)分子电荷及影响因素，包括pH值和盐等； (6)功能团。功能团为萃取剂和特异性吸附的选择提供依据； (7)免疫原性。设计亲和色谱； (8)稳定性及其影响因素，包括温度、pH值、毒性
