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1、 MicroRotofor TM Cell培训教程Bio-Rad2008年6月目 录 一、 仪器清点和客户实验准备二、 实验装置安装和实验操作三、 拆卸和清洗四、 故障排除五、 订货信息一、 仪器清点和客户实验准备1. 仪器清点1.1 MicroRotorfor Cel电泳仪主要部件图1 Micro Rotofor分离器的主要部件与附件(1) Micro Rotofor分离器底座与盖子，(2)收集盘，(3) 聚焦槽，(4a) 阴极，(4b)阳极，(5a)阴极膜，(5b)阳极膜，(6)10ml注射器，(7)3ml注射器，(8)镊子，(9)装配支架，(10)密封带，(11)清洁刷，(12)真空软管
2、，(13)真空槽Micro Rotofor分离器底座与盖子图2 底座部件 (1)位于真空腔的组份收集盘，(2)收集配置，(3)致冷区域，(4)电源接口，(5)致冷开关，(6)电源开关，(7)橡胶塞接口1.2用户自备PowerPac HV/PowerPac Unversial电源；真空泵：可以提供22-27 Hg真空度的真空泵都可使用；真空阀和真空管；电解液用于平衡离子交换膜：0.1M H3PO4与0.1M NaOH各6ml；20ul，100ul，1000ul移液器；移液器头；50ml烧杯2. Micro Rotofor TM Cell start kit主要组成试剂盒主要组成如下： Bio-L
3、yte pH 3-10 两性电解质，10ml（Catalog #163-1112） 标准蛋白质样品，1ml（Catalog # 170-2919） 藻青蛋白2mg蓝色蛋白pI 4.5-5.5,血色素2mg红色蛋白pI 6.0-7.5,细胞色素 C质2mg橙色蛋白pI 8.0-9.0 聚焦槽（1） 阳极膜（阳离子交换膜）：2个，在15ml 0.1M H3PO4 电解液中平衡 阴极膜（阴离子交换膜）：2个，在15ml 0.1M NaOH 电解液中平衡 收集盘（1） 样品上样注射器，3ml（1） 电解液加载注射器，10ml (1)二、实验装置安装和实验操作2.1 概述1. 在特定电解液中平衡离子交换
4、膜过夜(用Start Kit实验可略过此步)2. 组装聚焦槽并密封取样出口3. 将样品加入到聚焦槽中并密封上样口4. 在电极槽中加入电解液5. 将聚焦槽放入Micro Rotofor分离器底座，开始等电聚焦6. 切断电源，取下盖子并将Micro Rotofor分离器与真空泵相连7. 取下聚焦槽上的样品槽盖，并将其与收集装置连接8. 将分离的样品组份吸入收集盘（本实验以Micro Rotofor Cell Start Kit 170-2804为例）2.11 离子交换膜的平衡 (使用Start Kit可跳过此步)第一次使用的离子交换膜必须在电解液中平衡过夜（表3.1）。离子交换膜保存在电解液或去离
5、子水中可以循环使用4-5次。注释：膜在干质状态可无限期保存。平衡使用后必须保持湿润保存，否则膜易干裂引起电解液向聚焦槽的泄漏。表3.1 离子交换膜以及其平衡条件 其他电解液见6.5膜颜色（包装）电极电解液阳极膜（阳离子交换膜）红色阳极0.1M H3PO4阴极膜（阴离子交换膜）黑色阴极0.1M NaOH2.2 组装聚焦装置这步操作中包括如何放置电极膜以及电极槽和聚焦槽的组装。1. 使用去离子水清洗电极膜（离子交换膜）2. 分别将阳极膜（红色包装）和阴极膜（黑色包装）嵌入聚焦槽两端（图2） 图2 将阳极膜嵌入聚焦槽一端3. 将电极槽与聚焦槽组装a. 聚焦槽的阳极膜端连接电极的阳极（指示红色端）b.
6、 聚焦槽的阴极膜端连接电极的阴极（指示黑色端）4. 调节聚焦槽的上样口使其与电极的通气孔成一直线。（图3） 图3使聚焦槽的样品槽口与电极的通气孔成一直线2.3 准备并加载蛋白样品 蛋白样品制备：Start Kit中有三种有颜色的蛋白即藻青蛋白（蓝色蛋白），血色素（红色蛋白），细胞色素 C（橙色蛋白）。混旋样品后，取100ul蛋白样品（600ug），加入150ul Bio-Lyte pH 3-10 两性电解质，最后加入2.75ml去离子水使最终体积到3.0ml。再混旋使样品溶液混合均匀。加样：聚焦槽有两排出口，其中一排与电极通风孔成一直线用于加载样品，而与其相对的另外一排出口则用于样品的收集。在
7、加载样品前将取样口端密封。加载样品后，加载口端同样要求密封。1. 利用工具附件的模板剪裁核实的密封条带，用于对聚焦槽出口的密封。见图4。图4 利用模板剪裁合适长度的密封带2. 用密封带密封取样口，见图5。保证密封带恰好把取样口密封，不要剩余很多否则在仪器振荡时，容易松动，产生泄漏现象。图5用密封带密封取样口3. 用载样注射器吸取3ml样品溶液，从位于聚焦槽中央的载样口上样，至样品溶液全部均匀渗透到各个腔体内（见图6）；或者采用在不同载样口上样，至样品溶液在聚焦槽各个腔体分布均匀。注：在上样过程中注意不要产生气泡，否则样品溶液在各个腔体内分布不均匀。如果出现气泡，可以将样品吸出，从另外的载样口上
8、样，注意同样不能产生气泡。图6 在聚焦槽中加载样品4. 加载样品后，核实每一个聚焦腔体内是否充满样品溶液，并保证无气泡。如果存在气泡，将影响后续的分离，因此请按上步措施进行处理。5. 擦干聚焦槽外部，用密封带将上样口密封。不要使用过长或过宽的密封带，否则在仪器振荡过程中，密封带松动，容易产生溶液泄漏现象。2.4 聚焦实验1. 首先将致冷装置上的旋钮旋开。2. 将聚焦装置放入仪器底盘，聚焦槽上样口端和电极通气口端向上。核实阳极端（红色端）在左，阴极端（黑色端）在右。 轻轻将阳极推入底盘的阳极连接口（见图7）。 将聚焦槽放入致冷模块中并将阴极端轻轻滑入底盘的阴极凹槽中（见8）。旋转聚焦装置使该装置
9、与底盘凹槽更好吻合；或开动振荡装置，通过轻微振荡使其吻合。图7将聚焦装置放入仪器底盘的阳极端 图8将聚焦装置滑入仪器底盘的阴极凹槽3. 用10ml 注射器向电极中加入电解液（图9）。 注释：可以使用膜的保存液，或者使用新鲜电解液 在阳极通气口处（红色），向内加入6ml 0.1M H3PO4 电解液在阴极通气口处（黑色），向内加入6ml 0.1M NaOH电解液 图9 向阳极加入阳极电解液4 加盖致冷装置盖子，并旋紧螺杆。5. 加盖仪器盖子6. 连接Micro Rotofor TM分离器底盘后电源线和电源插座7. 连接Micro Rotofor TM分离器到真空装置。（最好在连接中有阀门可以控制
10、。）注意：在分离结束收集样品时才使用真空装置。8. 将开关“ON”，打开振荡装置9. 根据实验需要将致冷开关设置到（10）或（20）,本实验是（20），设置为（10）时，请将系统平衡约15min后再进行聚焦分离过程。设置为（20）时，可直接使用。注：用户根据所分离的蛋白设定不同的温度（20）适用不要求非变性蛋白质样品，如IEF（10）适用于非变性蛋白质样品，如蛋白质活性和结构分析等 关闭致冷系统。由于仪器运行时会产生大量热量，损害本仪器，不提倡使用。10. 将仪器盖子的电源口端插入电源，并调节到恒功率状态即1W。如果电源不能满足要求请参照3.5节进行多步恒电压程序。11. 整个聚焦过程大约需要
11、3h。通过观察电压变化过程，可以指示聚焦是否完成。如果电压稳定于某一值时，继续聚焦30min后收集组份。过长的聚焦时间不但不能提高聚焦效果，还会引起pH梯度的下降。12. 同时该聚焦过程可以通过样品中蛋白颜色的分离来观察。藻青蛋白有三个等电点即4.5、4.7、5.0，向阳极移动，预期在#3腔体中聚焦。血色素A和血色素C等电点分别是7.1和7.4，向中央移动，预期在#6、#7中聚焦。细胞色素C，等电点为9.6，向阴极移动，预期在#9或#10中聚焦。2.5电源条件恒功率推荐使用恒功率进行操作。下表详细表述了致冷设置信息，室温控制在19-26。致冷设置致冷设置功率恒定1W恒定1W电压100-350V
12、100-500V内部温度102202多步恒电压如果电源不能使用恒功率参数，请使用限电流下进行多步恒电压操作。推荐使用恒电流20mA和恒功率2W。下表对不同体系样品进行了详细的使用分析。对于含有2.5mg蛋白质的2% (w/v) Bio-LytepH3-10体系采用致冷设置，或7M尿素、2M硫脲、2mM TBP、4%CHAPS、2%(w/v)Bio-LytepH3-10体系采用致冷设置。根据蛋白质载样量、两性电解质的含量、pH范围的不同使用不同的电流范围，并需要不同的分离时间。表3.4 多步恒电压设置步骤致冷设置致冷设置电压/时间电流电压/时间电流1150V/15min10-5mA150V/10
13、min8-3mA2200V/15min7-2mA200V/10min4-2mA3300V/20min3-2mA300V/60min4-3mA4350V/20mn3mA5400V/60min3mA2.6 组份收集为防止样品扩散，聚焦结束后马上收集样品组份。1. 切断电源2. 切断振荡器和致冷装置的电源，打开Micro Rotofor TM分离器顶盖3. 核实Micro Rotofor TM分离器与真空装置相连，以及收集装置妥当4. 打开致冷装置顶盖，用镊子将密封带取下5. 打开真空装置6. 将聚焦装置小心的从仪器电极连接处取下，该过程始终保持聚焦槽样品槽口端向上（其密封带已经取下）。7. 将聚焦
14、装置放入收集装置顶端见下图。调整聚焦槽使其成水平，使排针与取样口平行，不要刺破取样口的密封带。8. 双手控制聚焦槽并向下方按下，使排针刺穿取样口的密封膜。过程中不能堵塞聚焦槽上样口。同时用双手的拇指将收集盘插入真空装置。9. 继续按压聚焦槽数秒，使分离的样品组份吸入收集盘10. 取下收集盘，关闭真空装置11. 用注射器或移液器将各组份样品转移到其他容器中三、拆卸和清洗31聚焦装置拆洗1. 用工具将电极装置与聚焦装置拆卸分离2. 用镊子将离子交换膜取出并放入去离子水或各自电解液中进行保存注释：平衡后的离子交换膜要求放在离子水或各自电解液中保存，如果保存不善引起膜的失水，膜将产生龟裂，从而引起电解液渗入聚焦槽，影响分离结果。3. 用去离子水清洗电极装置4. 将聚焦槽浸入2%SDS溶液过夜后用去离子水充分清洗32收集装置折洗收集结束后马上进行取样针的清洗以保证取样的重复性。使用温和洗涤剂对针进行清洗。1. 拆卸真空装置与底盘2. 旋开螺丝将取样装置从真空装置上取下，先后取下定位模具、排针和排针架3. 清洗并晾干定位模具4. 用洗瓶清洗排针上的每根取样针5. 清洗并晾
