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1、ISO 6888-1:1999食品和动物饲料的微生物学 血清凝固酶阳性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和其他球菌）序ISO是国际标准的全球性组织。准备国际标准这项工作通常由ISO技术联盟来完成。每一个团体成员负责各自的学科。与ISO有合作的国际性机构、政府与非政府机构，也有参与这项工作。ISO与国际电子组织（IEC）在电子标准化方面有着密切的合作关系。国际性标准的起草原则在ISO/IEC 细则第三部分中有给出。起草的国际性标准被技术委员会采用是通过全体成员投票决定的。发布一个国际性标准需要至少75成员投赞成票。国际性标准ISO 6888-1 由ISO/IEC 34技术委员会（农产品，小组委员会SC9，
2、微生物）起草的。ISO 6888-1的第一个版本，以及ISO 6888-2，取代ISO 6888：1983，做了计数上的修改。ISO 6888由以下部分组成，一般标题为食品与动物饲料微生物学一般方法计数血浆凝固酶阳性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和其它种类）：第一部分：方法使用BP琼脂培养基；第二部分：方法使用兔血浆纤维蛋白琼脂培养基。0. 绪论0.1 由于食品与饲料的种类繁多，这个标准不一定适合某一类产品。在这种情况下，可使用不同的方法，但必须有绝对的技术上的理由。否则，要尽可能地完全遵循本标准。当这个标准下一次回顾时，将会对这个标准的使用做数据统计，特殊产品偏离本标准使用也会做相关统计。同一类产
3、品的检测方法也有可能不统一，国际性标准和/或国家标准也不一定完全与本标准相符合。希望相关标准做回顾时，会遵循本标准做出相关的修改，以使只有已被证明的技术上的理由才能与本标准偏离。0.2 ISO 6888描述了两种平行的方法（第一部分和第二部分）来检测血浆凝固酶阳性葡萄球菌，其中以证明该菌产生肠毒素。其中较大可能是金黄色葡萄球菌，也有可能是中间链球菌或猪葡萄球菌。0.3 ISO 6888本部分的目的在于，葡萄球菌的证实基于血浆凝固酶的阳性反应，但也有研究证明一些受损的金黄色葡萄球菌会出现血浆凝固酶弱阳性。这种细菌可能会和其它种类的细菌混淆，但它能通过后续的试验区分开来，在本标准中没有做说明，例如
4、溶葡球菌酶敏感性，产生溶血素、耐热核酸酶，发酵甘露醇产酸（见参考文献2）。1 范围本标准适用于检测人类食物或动物饲料产品的血浆凝固酶阳性葡萄球菌的检测，通过计数BP平板35或37培养后的菌落数。2 参考标准 以下标准文件是本标准的参考标准。已过期的文献，后来改善或修订的，部分这种文献已经不适用。然而，有大部分学者正在争取发布最新版的文献如以下列出。对于无限期的文献，最新版本都是适用的。ISO和IEC成员保存当前有效国际性标准的记录。ISO 6887-1，食物与动物饲料原料微生物学样品准备原则，微生物检测样品原液及十倍法稀释第一部分：样品原液和十倍法稀释的指导准则。ISO 7218，食物与动物饲
5、料原料微生物学微生物检验指导准则。3 术语与定义 本标准中使用的相关术语与定义如下。3.1 血浆凝固酶样品葡萄球菌在选择性平板上的典型和/或不典型菌落，按照本标准操作呈现凝固酵素阳性反应。3.2 血浆凝固酶阳性葡萄球菌计数 按照本标准操作，得出血浆凝固酶阳性葡萄球菌每克或每毫升样品的含量。4 原理4.1 接种固体选择性培养基表面，做两个平行，如果为液体样品，接种一定体积的样品，如果是其它类型的样品，接种一定体积的样品悬液。在同样的条件下，接种样品或样品悬液的十倍稀释溶液，每个梯度两个平行。4.2 在需氧条件下35或37培养，然后24h和48h检查。4.3 计算每克或每毫升样品中血浆凝固酶阳性葡
6、萄球菌的数量，稀释梯度的选择和平板上典型与不典型菌落的数量都有重要的意义，并通过凝固酵素试验确证。5 稀释液与培养基5.1 概要正确的实验室操作，参照ISO 7218。5.2 稀释液参照ISO 6887-1 和特殊产品的相关标准。5.3 BP琼脂培养基注意：商业上可买到的培养基可以使用。必须参照厂商的说明书操作。5.3.1 基础培养基5.3.1.1 成分胰消化酪蛋白酵母膏肉提取物丙酮酸盐钠L糖胶氯化锂琼脂水10.0g1.0g5.0g10.0g12.0g5.0g12g22g1000ml5.3.1.2 准备将所有成分或培养基干粉溶解于水中并煮沸。如需要，调整pH值至7.20.2，在25下。将培养基
7、转移至适当容量的三角瓶中，每瓶100ml。121灭菌15min。5.3.2 配套试剂5.3.2.1 亚碲酸盐钠5.3.2.1.1 成分亚碲酸盐钠水1.0g100ml5.3.2.1.2 准备 将亚碲酸盐钠充分溶解在水中，最小程度加热。固体粉末应该是易溶的。如果有白色的不溶物出现，丢弃该粉末。过滤0.22m孔膜灭菌。在32保存期不超过1个月。如有白色混浊，丢弃它。5.3.2.2 蛋黄乳状液注意：如果有商业的成品，可以使用。使用有完整外壳的新鲜鸡蛋。用液体清洁剂将表面刷干净。在流动水下冲洗干净。然后在70乙醇中浸泡30s消毒，自然晾干，或者喷射酒精后用火焰灭菌。在无菌环境下，打开鸡蛋并将蛋黄从蛋白中
8、分离出来。将蛋黄放入灭菌三角瓶中，加入四倍体积无菌水。充分混匀。在47水浴锅中加热2h，然后在32下保存18h24h，使之形成沉淀物。无菌的收集澄清液体至无菌容器中待使用。该乳状液在32下最大保存期为72h。5.3.2.3磺胺二甲嘧啶溶液注意：该溶液仅使用于容易变化的样品中。5.3.2.3.1 成分磺胺二甲嘧啶氢氧化钠溶液（0.1mol/l）水0.2g10ml90ml5.3.2.3.2 准备将磺胺二甲嘧啶溶解在氢氧化钠溶液中，用水稀释至100ml。过滤0.22m孔膜灭菌。在32保存期不超过1个月。5.3.3 完全培养基5.3.3.1 成分基础培养基亚碲酸钠溶液蛋黄乳状液将磺胺二甲嘧啶溶液100
9、ml1.0ml5.0ml2.5ml5.3.3.2 准备融化基础培养基，水浴冷却至47。然后，在无菌条件下，添加亚碲酸钠溶液和蛋黄乳状液，如有必要，添加将磺胺二甲嘧啶溶液。每一种溶液都必须水浴预热至47。然后充分混匀。5.3.4 准备琼脂平板 倾注适当量培养基至无菌平皿中，以获得4mm厚度平板，并凝固。在使用之前，要烘干平板表面水分，可在2550培养箱中烘干。5.4 脑心浸液肉汤5.4.1 成分动物组织消化酶脱水牛脑溶液脱水牛心溶液葡萄糖氯化钠无水磷酸氢二钠水10.0g12.5g5.0g2.0g5.0g2.5g1000ml5.4.2 准备将各成分或脱水干粉培养基于水中，如需要可加热。调整pH值至
10、7.20.2，在25下。将培养基转移至适当容积的玻璃管中，每管5ml10ml。121灭菌15min。5.5 兔血浆使用商业成品并根据厂商说明再水化。如果购买不到成品兔血浆，用三倍体积无菌水稀释灭菌的新鲜兔血。添加EDTA，使其在溶液中的含量为0.1，如果兔血中含有柠檬酸钾或柠檬酸钠。再水化或自制的兔血浆须立即使用。在使用之前，用血浆凝固酶阳性葡萄球菌做阳性质控。6 设备及玻璃器皿一般的微生物实验室设备（参照ISO 7218），特别的，增加以下几项。6.1 干热灭菌和湿热灭菌设备6.2 培养箱，可恒温351或3716.3 干燥箱或培养箱，可恒温251和5016.4 水浴锅，可恒温4726.5 试
11、管，三角瓶带螺帽6.6 灭菌平皿，玻璃或塑料的6.7 接种针和接种环6.8 移液器，1ml，2ml和10ml，分割分别为0.1ml，0.1ml和0.5ml6.9 灭菌的涂布棒，玻璃或塑料的6.10 pH计7 取样ISO 6888中并不涉及取样。如果没有相关的国际标准，建议需经过多方同意。微生物实验室接收到的样品必须是真实代表样品的，并在运输和储藏期间没有损坏或改变微生物的性状。8 样品前处理参照样品的相关国际标准进行前处理。如果没有相关的国际标准，建议需经过多方同意。9 程序9.1 测试部分，样品原始悬液和稀释参照ISO 6887-1，相关细节可参考各个样品的标准。9.2 接种9.2.1如果样
12、品为液体，各吸取0.1mL样液至两个BP平板上，涂布平板，如果样品为非固体，则吸取1：10稀释度样液0.1mL至BP平板上，依次类推，检测1：100或更多的稀释度。9.2.2若是样品的金黄色葡萄球菌限度较低，可吸取1.0mL样液涂布平板，得到更低检出结果。1mL样液可涂布到一个大的140mm直径平板，或三个小的90mm平板上。9.2.3小心涂布平板，注意不要涂到平板的边缘上。涂布完毕，盖好平板，室温静置15min至干燥。9.3 培养35或37培养，24h和48h观察结果。9.4 挑选平板及计数9.4.1 平板计数培养24h后，在平板背面标识典型菌落。继续培养24h，标识新长出的典型菌落。（典型
13、菌落为黑色或灰色，光亮凸起，培养24h后，直径为11.5mm，培养48h后，直径为1.52.5mm。周围有部分不透明的浑浊圈。非典型菌落和典型菌落的大小一致，黑色光亮有乳白色边缘，不带浑浊圈，或者是灰色菌落。）挑取菌落总数小于300个，含有15150个典型或非典型菌落的平板计数。挑取5个菌落做证实试验（若平板中只有典型菌落，则挑取5个典型菌落；若只有非典型菌落，则挑取5个非典型菌落；若同时存在典型和非典型菌落，则挑取5个典型菌落和5个非典型菌落）。如果最低稀释度平板上少于15个典型或非典型菌落，可按照9.4.3和10.2估计读数。9.4.2若取1mL涂布到三个平板上，计数三个平板的菌落总数。9
14、.4.3估计平板的金黄色葡萄球菌菌落总数，保留存在典型或非典型菌落的平板，把所有菌落跳出做鉴定试验。9.5证实试验将挑选的菌落接种至脑-心浸萃液态培养基中，35或37培养24h。在0.3mL的培养液中加入0.1mL兔血浆，35或37培养。培养46h后，倾斜培养管检查是否凝固。若为阴性反应，延长培养时间至24h。10 结果表达10.1计算每个平板上金黄色葡萄球菌的菌落数，记为abcAcccbncAnc+a=cnc其中Ac选取做证实试验的典型菌落数；Anc选取做证实试验的非典型菌落数；bc血浆凝固酶阳性的典型菌落数；bnc血浆凝固酶阳性的非典型菌落数；cc平板上典型菌落总数；cnc平板上非典型菌落
15、总数。10.2计算样品中金黄色葡萄球菌菌落数，记为NNaV(n1+0.1n2)d其中a所有平板上阳性菌落的总数；V每个平板上接种体的体积，mL；n1第一个稀释度被选用的平板数；n2第二个稀释度被选用的平板数；d第一个稀释梯度的稀释度（如10-1）。11 精密度11.1 概述方法的精密度可表现为重复性和再现性，在ISO 5725-2中有定义。然而，ISO 5725-2中基于这个定义的计算，并不适用于所有微生物分析。因此，本标准也参考ISO 16140，它已将微生物分析独立开来。这些统计学的优势在于对极端评估不会过于敏感。这些评估在旧版的ISO 6888中有适用过。在附录A中有多个实验室对精密度进行
