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1、第十章 免疫学反应与标记技术,主讲人： 周志娟,知识目标,了解抗原抗体反应的一般规律 掌握抗原、抗体反应的类型 了解常用的免疫标记技术,第十章 免疫学反应与标记技术,第十章 免疫学反应与标记技术,能进行凝集反应试验并能判断抗体的效价 能进行沉淀反应试验 能进行血凝及血凝抑制实验， 能测定病毒的血凝效价 能进行酶联免疫吸附实验,能力目标：,免疫学反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。 抗原与相应抗体间的特异性结合反应既可发生于体内，也可发生于体外。由于抗体主要存在于血清中，在体外进行的抗原抗体反应多采用血清进行试验，因此体外抗原抗体反应也称为血清学反应。 血清学反应是一种常用的检测抗
2、原或抗体的方法。,第十章 第一节 免疫学 反 应,概 述,抗原、抗体反应的一般规律,退 出,抗原、抗体反应的种类,第十章 第一节 免疫学 反 应,概 述,抗原、抗体反应的一般规律,退 出,抗原、抗体反应的种类,一、抗原、抗体反应的一般规律,1.特异性与交叉性 2.可逆性 3.定比性 4.阶段性 5.条件性 （1）电解质 （2）酸碱度 （3）温度,第十章 第一节 免疫学 反 应,概 述,抗原、抗体反应的一般规律,退 出,抗原、抗体反应的种类,二、抗原、抗体反应的种类,(一)凝集反应 1.直接凝集反应 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体直接结合所呈 现的凝集现象称为直接凝集反应。,玻片法：定性试验
3、 试管法：定量试验,2.间接凝集反应 将可溶性抗原吸附于一 种与免疫无关的载体颗粒表面， 形成致敏颗粒，然后与抗体结 合，在有电解质存在的适宜条 件下，发生的凝集反应称为间 接凝集反应。,第十章 第一节 免疫学 反 应,概 述,抗原、抗体反应的一般规律,退 出,抗原、抗体反应的种类,二、抗原、抗体反应的种类,间接血凝试验 间接乳胶凝集试验,3.间接凝集抑制反应 将可溶性抗原与相应抗 体预先混合并充分作用后， 再加入致敏的载体，因抗体 已被可溶性抗原结合，阻断 了与载体上的抗原作用，不 出现凝集现象（凝集反应被抑制），称间接凝集抑制反应。,第十章 第一节 免疫学 反 应,概 述,抗原、抗体反应的
4、一般规律,退 出,抗原、抗体反应的种类,二、抗原、抗体反应的种类,第十章 第一节 免疫学 反 应,概 述,抗原、抗体反应的一般规律,退 出,抗原、抗体反应的种类,二、抗原、抗体反应的种类,4.协同凝集反应 反应原理与间接凝集相类似，但所用载体为金黄 色葡萄球菌。 金黄色葡萄球菌细胞壁中含有的葡萄球菌A蛋白 （SPA）具有与IgG的Fc段结合的特性。当IgG的Fc段与 SPA结合后，其Fab段与相应抗原结合就会出现凝集反 应。 协同凝集反应广泛应用于多种细菌和某些病毒的快 速诊断。,第十章 第一节 免疫学 反 应,概 述,抗原、抗体反应的一般规律,退 出,抗原、抗体反应的种类,二、抗原、抗体反应
5、的种类,5.病毒的血凝及血凝抑制反应 许多病毒具有的能凝集某些动物红细胞的特性称 为病毒血凝反应。 病毒血凝反应被特异性的抗体所抑制的反应称为 病毒的血凝抑制反应。,第十章 第一节 免疫学 反 应,概 述,抗原、抗体反应的一般规律,退 出,抗原、抗体反应的种类,二、抗原、抗体反应的种类,（二）沉淀反应 可溶性抗原与相应抗体结合，在适量电解质存在下， 聚合成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀反应。 沉淀反应中的抗原称为沉淀原，抗体称为沉淀素。,第十章 第一节 免疫学 反 应,概 述,抗原、抗体反应的一般规律,退 出,抗原、抗体反应的种类,1.环状沉淀反应 2.絮状沉淀反应 3.免疫扩散 （1）单向单扩
6、散 （2）单向双扩散 （3）双向单扩散 （4）双向双扩散,单向单扩散,二、抗原、抗体反应的种类,第十章 第一节 免疫学 反 应,概 述,抗原、抗体反应的一般规律,退 出,抗原、抗体反应的种类,双向单扩散,双向双扩散几种不同结果,二、抗原、抗体反应的种类,第十章 第一节 免疫学 反 应,概 述,抗原、抗体反应的一般规律,退 出,抗原、抗体反应的种类,4.免疫电泳技术 免疫电泳技术是免 疫扩散与电泳技术相结 合的免疫检测技术。 （1）免疫电泳 （2）对流免疫电泳 （3）火箭免疫电泳,免疫电泳图,二、抗原、抗体反应的种类,第十章 第一节 免疫学 反 应,概 述,抗原、抗体反应的一般规律,退 出,抗原
7、、抗体反应的种类,二、抗原、抗体反应的种类,对流免疫电泳,火箭免疫电泳,第十章 第一节 免疫学 反 应,概 述,抗原、抗体反应的一般规律,退 出,抗原、抗体反应的种类,二、抗原、抗体反应的种类,（三）补体结合反应 是一种在补体参与的条件下，以绵羊红细胞和溶 血素作为指示系统来测定检测系统中有无相应抗原或 抗体的血清学反应。 参与反应的五种成分可分为两个系统： 检测系统：已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗 原）； 指示系统（溶血系统）：绵羊红细胞和相应溶血素 （抗绵羊红细胞抗体） 此外还有补体成分（豚鼠新鲜血清）。,第十章 第一节 免疫学 反 应,概 述,抗原、抗体反应的一般规律,退 出,抗原、
8、抗体反应的种类,二、抗原、抗体反应的种类,第十章 第一节 免疫学 反 应,概 述,抗原、抗体反应的一般规律,退 出,抗原、抗体反应的种类,二、抗原、抗体反应的种类,（四）中和反应 由特异性抗体抑制相应抗原的生物学活性的反应 称为中和反应。 进行中和反应的抗原主要为病毒和细菌外毒素。 凡能与病毒结合，使其失去感染力的抗体称中和 抗体。 能与细菌外毒素结合，中和其毒性作用的抗体称 为抗毒素。,第十章 第二节 免疫标记技术简介,概 述,荧光标 记技术,退 出,酶标记 技术,发光免疫 测定技术,免疫电 镜技术,放射免疫 测定技术,免疫标记技术是根据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感性建立的技术。 抗
9、原能与抗体特异性地结合，但这种结合在抗原抗体含量低时是不可见的。有一类物质即使在超微量时也能通过特殊的理化方法将其检测出来，若用这类物质作标记物，标记抗原或抗体，再进行抗原抗体反应，就可以通过检测标记物来显示抗原抗体复合物的存在。 免疫标记技术包括荧光标记技术、酶标记技术、放射免疫测定技术、免疫电镜技术 、发光免疫测定技 术等。,第十章 第二节 免疫标记技术简介,概 述,荧光标 记技术,退 出,酶标记 技术,发光免疫 测定技术,免疫电 镜技术,放射免疫 测定技术,一、荧光标记技术,（一）荧光的产生 荧光素能从外界吸收并储存能量（如光能、化学 能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时， 过
10、剩的能量能以光量子的形式释放出去，这种因激发 而发射出来的光称为荧光。,第十章 第二节 免疫标记技术简介,概 述,荧光标 记技术,退 出,酶标记 技术,发光免疫 测定技术,免疫电 镜技术,放射免疫 测定技术,（二）荧光色素 能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合 物称为荧光色素，简称荧光素。 作为标记的荧光素应符合以下要求： 荧光分子必须在激发态有一定的稳定性，即能保持 约10-8s的时间； 与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降 解产物易于清除； 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性 质；,一、荧光标记技术,第十章 第二节 免疫标记技术简介,概 述,荧光标 记技术,退 出,
11、酶标记 技术,发光免疫 测定技术,免疫电 镜技术,放射免疫 测定技术,与蛋白质的结合物稳定，易于保存； 荧光效率高，与蛋白质结合的需要量很少； 荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明； 标记方法简单、安全无毒。 目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光 素(FITC)、四乙基罗丹明(RB200)和四甲基异硫氰酸 罗丹明（TMRITC）。,一、荧光标记技术,第十章 第二节 免疫标记技术简介,概 述,荧光标 记技术,退 出,酶标记 技术,发光免疫 测定技术,免疫电 镜技术,放射免疫 测定技术,一、荧光标记技术,（三）荧光抗体的制备 1.荧光素标记 （1）直接标记法 （2）透析法 2.荧光抗体的鉴定 包
12、括化学鉴定、染色滴度鉴定和特异性鉴定。 3.荧光抗体的保存,第十章 第二节 免疫标记技术简介,概 述,荧光标 记技术,退 出,酶标记 技术,发光免疫 测定技术,免疫电 镜技术,放射免疫 测定技术,一、荧光标记技术,（四）荧光抗体的染色 1.标本的制作 2.染色方法 （1）直接法 （2）间接法 （五）荧光显微镜检查,第十章 第二节 免疫标记技术简介,概 述,荧光标 记技术,退 出,酶标记 技术,发光免疫 测定技术,免疫电 镜技术,放射免疫 测定技术,二、酶标记技术,（一）原理 酶分子与抗原或抗体分子以共价键结合后，形成酶 标抗原或酶标抗体。 酶标抗原或酶标抗体与相与的抗体或抗原相互结合 形成酶标
13、免疫复合物。此复合物中所带的酶分子遇到底 物时，能催化底物水解、氧化或还原，产生显色反应。 因此可借底物的的颜色反应来判断有无相应的免疫 反应。,第十章 第二节 免疫标记技术简介,概 述,荧光标 记技术,退 出,酶标记 技术,发光免疫 测定技术,免疫电 镜技术,放射免疫 测定技术,二、酶标记技术,（二）常用的标记酶及显色底物 用于标记的酶应具有以下特点： 催化活性高，催化专一性强，稳定性和溶解度好； 与抗体偶联后不影响酶活性和抗体的免疫反应性； 催化的底物易于配制、保存且催化后的产物易于观 察和检测； 对人无害，价廉、易得。,第十章 第二节 免疫标记技术简介,概 述,荧光标 记技术,退 出,酶
14、标记 技术,发光免疫 测定技术,免疫电 镜技术,放射免疫 测定技术,二、酶标记技术,常用酶及底物,第十章 第二节 免疫标记技术简介,概 述,荧光标 记技术,退 出,酶标记 技术,发光免疫 测定技术,免疫电 镜技术,放射免疫 测定技术,二、酶标记技术,（三）标记物的制备 1.戊二醛交联法 2.过碘酸钠法,第十章 第二节 免疫标记技术简介,概 述,荧光标 记技术,退 出,酶标记 技术,发光免疫 测定技术,免疫电 镜技术,放射免疫 测定技术,二、酶标记技术,（四）酶标记技术的分类 1.酶免疫组化技术 （1）标本的制备和处理 消除内源酶 消除背景染色 （2）染色方法 直接法 间接法 （3）标本观察,第
15、十章 第二节 免疫标记技术简介,概 述,荧光标 记技术,退 出,酶标记 技术,发光免疫 测定技术,免疫电 镜技术,放射免疫 测定技术,2.酶免疫测定技术 （1）酶联免疫吸附试验(ELISA) 原理： 先将抗体（或抗原）包被到某种固相载体表面，并 保持其免疫活性。将待检样本和酶标抗体（或抗原）按 不同步骤与固相载体表面吸附的抗体（或抗原）发生反 应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合 成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的 颜色及其吸收光度值的大小用肉眼或分光光度计进行定 性或定量分析。,二、酶标记技术,第十章 第二节 免疫标记技术简介,概 述,荧光标 记技术,退 出,酶标记
16、 技术,发光免疫 测定技术,免疫电 镜技术,放射免疫 测定技术,二、酶标记技术,常用的固相载体 ELISA中最常用的固相载体用聚苯乙烯制备，可制 成聚苯乙烯微量滴定板、聚苯乙烯球珠。现多用微量滴 定板。 包被 将抗原或抗体吸附于固相载体表面的过程，称载 体的致敏或包被。 洗涤 常用的是含0.05%的吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBS） 作洗涤液。,第十章 第二节 免疫标记技术简介,概 述,荧光标 记技术,退 出,酶标记 技术,发光免疫 测定技术,免疫电 镜技术,放射免疫 测定技术,二、酶标记技术,实验方法:间接法、双抗体夹心法、竟争法,间接法,第十章 第二节 免疫标记技术简介,概 述,荧光标 记技术,退 出,酶标记 技术,发光免疫 测定技术,免疫电 镜技术,放射免疫 测定技术,二、酶标记技术,夹心法,第十章 第二节 免疫标记技术简介,概 述,荧光标 记技术,退 出,酶标记 技术,发光免疫 测定技术,免疫电 镜技
