微生物基因工程第六章节1课件

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1、第六章 外源基因的表达,6.1 基因表达的机制 6.2 基因表达的调控元件 6.3 影响外源基因表达的因素 6.4 外源蛋白的融合表达及分泌表达 6.5 大肠杆菌基因表达系统 6.6 酵母基因表达系统 6.7 哺乳动物基因表达系统 6.8 基因表达产物的检测与分离纯化,6.1 基因表达的机制,6.1.1 外源基因的起始转录 6.1.2 mRNA的延伸与稳定性 6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译 6.1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性 6.1.5 目的基因沉默,6.1.1 外源基因的起始转录,选择可调控启动子和相关调控序列 原核生物：诱导型启动子和组成型启动子 诱导型启动子：lac、trp、

2、PR、PL、tac 组成型启动子：T7 真核生物：启动子和增强子,6.1.2 mRNA的延伸与稳定性,外源基因起始转录后，保持mRNA的的有效延伸、 终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。 在构建表达载体时，尽量避免衰减子序列、加入抗终止序列，转录终止序列、poly(A)掺入位点（真核生物）。 选择RNase缺失受体菌（原核生物）。,6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译,在原核细胞中影响翻译的起始因素有：起始密码子、核糖体结合位点（SD序列）、起始密码与SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结构、mRNA上游的5非翻译序列和蛋白质编码区的5端序列等。 外源基因mRNA有效翻译须考虑的

3、基本原则 原核生物 真核生物,6.1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性,外源基因表达产物能否在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白水解酶水解是基因有效表达的一个重要因素。 避免外源基因表达蛋白降解的措施： (1) 构建融合蛋白表达系统 (2) 构建分泌蛋白表达系统 (3) 构建包涵体表达系统 (4) 选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统,6.1.5 目的基因沉默,目的基因沉默(gene silencing)： 某种原因导致外源基因不能正常表达 主要表现在转基因动物和植物中 位置效应的基因沉默 转录水平的基因沉默 转录后水平的基因沉默,6.2 基因表达的调控元件,6.2.1 启动子 6.2.2 增强子 6

4、.2.3 终止子 6.2.4 衰减子、绝缘子和反义子,6.2.1 启动子,启动子 定义、特征 （1）序列特异性 （2）方向性 （3）位置特性 （4）种属特异性 原核生物启动子 真核生物启动子,6.2.2 增强子,增强子(enhancer)：能增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列，由多个元件组成，每个元件可以与一种或多种转录调控因子结合。 增强子的特性： (1) 双向性 (2) 重复序列 (3) 增强子行使功能与所处位置无关 (4) 特异性 (5) 增强子与同源或异源基因相连时均有调控功能,6.2.3 终止子,终止子(terminator) 本征终止子 不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的结构区

5、内实现终止作用。 依赖型终止子 需要其他蛋白辅助因子才可在特殊的结构区内实现终止作用。,6.3 影响外源基因表达的因素,6.3.1 外源基因的表达效率 6.3.2 表达质粒的拷贝数和稳定性 6.3.3 表达产物的稳定性 6.3.4 工程菌的培养条件 6.3.5 细胞的代谢负荷,6.3.1 外源基因的表达效率,启动子的强弱 核糖体结合位点的有效性 SD 序列和起始密码子AUG 的间距 密码子组成,6.3.2 表达质粒的拷贝数和稳定性,6.3.3 表达产物的稳定性 组建融合基因，产生融合蛋白 产生可分泌的蛋白 外源蛋白可以在宿主细胞中以包涵体形式表达 选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞 采用位点特

6、异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性,6.3.4 工程菌的培养条件,优化发酵过程 工艺因素 如选择合适的发酵系统或生物反应器 生物学因素 首先是与细菌生长密切相关的条件或因素，如发酵系统中的溶氧、pH 值、温度和培养基的成分等 对外源基因表达条件的优化是提高外源基因表达产物的总量。 外源基因表达产物的总量取决于外源基因表达水平和菌体浓度,6.3.5 细胞的代谢负荷,外源基因在细菌中高效表达，必然影响宿主的生长和代谢，而细胞代谢的损伤，又必然影响外源基因的表达。合理地调节好宿主细胞的代谢负荷与外源基因高效表达的关系，是提高外源基因表达水平不可缺少的一个环节,6.4 外

7、源蛋白的融合表达及分泌表达,6.4.1 基因融合表达外源蛋白的原因 6.4.2 基因融合的策略 6.4.3 外源基因在大肠杆菌中的分泌表达,6.4.1 基因融合表达外源蛋白的原因,外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解 通过与一特异性的蛋白质或其特异的结构域形成融合蛋白，可使表达产物得到快速、有效的回收、纯化 通过与特定的肽段进行融合表达，可以将表达的外源蛋白质定向地定位在宿主细胞的不同区位。 通过同特定蛋白先形成融合蛋白，然后再通过体外切割去除融合部分，是获得天然蛋白的一种更可靠和可重复性的方法。 通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，使外源蛋白在细胞内进行可溶性表达，防止包涵体的形成,6.4.2

8、基因融合的策略,最简单的融合方式是将重组基因直接剪接于适当的信号肽序列之后 将外源基因本身按阅读框架自我融合 目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴(fusion partner)序列的C 端或N 端融合 分泌-亲和融合 双亲和融合法 分泌-插入融合法,6.4.3 外源基因在大肠杆菌中的分泌表达,外源蛋白在大肠杆菌中的分泌表达的优点： 便于简化发酵后处理的纯化工艺 保证表达的外源蛋白具有正确的天然一级结构 外源蛋白的生物活性的高低，依赖于蛋白正确折叠，而分泌表达设计，有利于正确构象的形成 分泌蛋白减少了重组蛋白受到蛋白水解酶降解的机会，提高蛋白回收率,6 .5 外源基因在大肠杆菌中的表达,6.5.1 大

9、肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势 6.5.2 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 6.5.3 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 6.5.4 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策,6.5.1 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征、大肠杆菌表达外源基因的优势,全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物,6.5.2 外源基因在大肠杆菌中 高效表达的原理,启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数,终止子 强化转录终止的必要性 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发

10、生转录过头现象，即RNA聚合酶滑 过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因 本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标 记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编

11、码产物的翻译效率,核糖体结合位点,外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）,核糖体结合位点,核糖体结合位点的结构 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5 UAAGGAGG 3，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3端区域3 AUUCCUCC

12、5并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5 端若干密码子的碱基序列,核糖体结合位点,核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD序列的影响： 一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低,核糖体结合位点对外源

13、基因表达的影响,SD序列与起始密码子之间的序列的影响： SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,SD序列与起始密码子之间的距离的影响： SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，S

14、D序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,起始密码子及其后续若干密码子的影响： 大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5 端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳

15、的,密码子,生物体对密码子的偏爱性 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是： 生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体X174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势 密码子与反密码子相互作用的自由能性中等强度规律 如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少； 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多； 细胞内tRNA的含量,密码子偏爱性对外源基

16、因表达的影响,由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程度的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。 一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达： 外源基因全合成 同步表达相关tRNA编码基因,密码子偏爱性对外源基因表达的影响,外源基因全合成 按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法,密码子偏爱性对外源基因表达的影响,同步表达相关tRNA编码基因 对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412个密码子中，共含有22个精氨酸密码子，其中7个AGG、2个AGA，而大肠杆菌受体细胞中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的高效