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1、1. 生物技术制药分为哪些类型？生物技术制药分为四大类：（1） 应用重组DNA技术(包 括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂。（2） 基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等（3） 来自动物、植物和微生物的天然生物药物（4） 合成与部分合成的生物药物2生物技术制药具有什么特征？（1）分子结构复杂（2）具有种属特异性（3）治疗针对性强，疗效高（4）稳定性差（5）基因稳定性（6）免疫原性（7）体内的半衰期短（8）受体效应（9）多效性（10）检验的特殊性3.生物技术制药中有哪些应用？应用主要有：（1） 基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基
2、因工程抗体，基因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用，利用转基因动植物生产蛋白质类药物（2） 细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢产物（3） 抗体工程制药（4） 酶工程制药（5） 发酵工程制药4.基因工程药物制造的主要程序有哪些？基因工程药物制造的主要步骤有：目的基因的克隆，构造DNA重组体，构造工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化产品的检验5.影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？（1）外源基因的计量（2）外源基因的表达效率：a、启动子的强弱
3、 b、核糖体的结合位点 c、SD序列和起始密码的间距 d、密码子组成（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢付荷（5）工程菌的培养条件6.质粒不稳定分为哪两类，如何解决质粒不稳定性？质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象；质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排，缺失所致工程菌性能的改变。提高质粒稳定性的方法如下：（1） 选择合适的宿主细菌（2） 选择合适的载体（3） 选择压力（4） 分阶段控制培养（5） 控制培养条件（6） 固定化7.影响基因工程菌发酵的因素有哪些？如何控制发酵的各种参数？影响因素：（1） 培养基（2） 接
4、种量（3） 温度（4） 溶解氧（5） 诱导时机的影响（6） 诱导表达程序（7） PH值8.什么是高密度发酵？影响高密度发酵的因素有哪些？可采取哪些方法来实现高密度发酵？高密度发酵：是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L影响因素：（1）培养基 （2）溶氧浓度 （3）PH (4)温度 （5）代谢副产物实现高密度发酵的方法：（1） 改进发酵条件：a、培养基 b、建立流加式培养基 c、提高供养能力（2） 构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌：a、阻断乙酸产生的主要途径 b、对碳代谢流进行分流 c、限制进入糖酵解途径的碳代谢流 d、引入血红蛋白基因（3） 构
5、建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌9.分离纯化常用的色谱分离方法有哪些?它们的原理是什么?方法有离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱。（1） 离子交换色谱IEC：是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。（2） 疏水层析HIC：是利用蛋白质表面的疏水区与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组进行分离的层析方法。（3） 亲和层析AC：是利用固定化配体与目的蛋白质之间的非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。（4） 凝胶过滤层析
6、：以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。10.对由基因重组技术所获得的蛋白质药物进行鉴定时，常做哪些项目分析？基因工程药物质量控制主要包括以下几点：产品的鉴别，纯度，活性，安全性，稳定性和一致性项目分析主要有：（1） 生物活性测定（2） 理化性质鉴定（3） 蛋白质含量鉴定（4） 蛋白质纯度分析（5） 杂志检测（6） 稳定性考察（7） 产品一致性的保证11.离体培养的动物细胞分为哪些类型?分为三类：（1） 贴壁细胞：细胞生长必须有可以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长增殖。（2） 悬浮细胞：细胞的生长不依赖支持物表面，
7、可在培养液中悬浮状态生长（3） 兼性贴壁细胞：既可 贴附于支持物表面生长，又在悬浮生长。12.生产用的动物细胞有哪些种类？它们各有什么特点？答：（1）生产用的动物细胞的种类：原代细胞系、二倍体细胞系、转化细胞、融合细胞系、重组工程细胞系（2）它们各自的特点：（A）二倍体细胞系的特点：染色体组型仍然是2n的核型具有明显的贴壁依赖和接触抑制的特性只有有限的增值能力，一般可连续传代培养50代物致瘤性（B）转化细胞系的特点：具有无限生命力倍增时间较短对培养条件和生长因子等要求较低（C）融合细胞系的特点：可使不同的动物和动物细胞融合可是动物和植物细胞融合13.常用的培养动物细胞的培养基的种类有哪些？（1
8、）天然培养基（2）合成培养基（3）无血清培养基14.如何进行动物细胞大规模培养？大规模培养的方法：（1） 悬浮细胞（2） 贴壁细胞（3） 贴壁悬浮细胞：a、微载体培养 b、包埋和微囊培养 c、结团培养大规模培养的操作方式：（1）分批式操作；（2）半连续式操作；（3）灌流式操作15.动物细胞生物反应器必须具备哪些基本要求？有哪些类型？特定是什么？动物细胞反应器具备的基本要求：（1） 制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基，细胞直接接触的材料，对细胞必须是无毒性的。（2） 生物反应器的结构必须使之具有良好的传质、传热和混合的性能（3） 密封性良好，可避免一切外采的不需要的微生物污染。（4）
9、 对培养基环境中多种物理化学参数能自动检测和调节控制，控制的精度高 ，而且能保持环境质量的均一。（5） 可长期连续运转，这对于培养动物细胞的生物反应器显得尤其重要。（6） 容器加工制造时要求内面光滑，无死角，以减少细胞或微生物的沉积。（7） 拆装，连结和清洁方便，能耐高压蒸汽消毒，便于操作维修（8） 设备成本尽可能低。反应器类型及特点：（1） 搅拌罐式生物反应器：主要用于是悬浮细胞培养，微载体培养，微囊和巨载体培养以及结团培养（2） 气升式生物反应器：气体通过装在罐底的喷管进入 反应器的导流管，致使该部液体的密度小于导流管外部的液体形成循环流。（3） 中空纤维式生物反应器：占地空间小，产品产量
10、、质量高，生产成本低，不能重复使用，不能耐高压蒸汽灭菌，需用环氧乙烷或其它消毒剂灭菌，难以取样检测。（4） 透析袋或膜式生物反应器：可使细胞达到高密度 ，又可随意组合进行操作，对产品进行浓缩纯化。（5） 固定床或流化床生物反应器：结构简单，装填材料易得。16.动物细胞制药有哪些新进展？ 答：改进表达载体，提高表达水平和产量利用代谢工程改进培养工艺抑制细胞凋亡，延长培养周期采用糖基化工程，提高产品质量转基因动物的研究组织工程研究17.什么是单克隆抗体？单克隆抗体有哪些不足？单克隆抗体：是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的抗体。不足：（1） 单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人
11、体内可产生人抗鼠抗体，加速了排斥反应，在人体内半衰期只有5-6h，难以维持有效药物作用靶组织时间。（2） 完整的抗体分子，即Ig的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效治疗浓度。18单克隆抗体的制备过程：制备抗原用抗原免疫动物得到抗体提取小鼠B淋巴细胞核骨髓肿瘤细胞细胞融合杂交瘤细胞的选择培养杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的克隆化单克隆抗体的鉴定单克隆抗体的纯化19基因工程抗体有哪些类型？其特性和制备方法有什么不同？答：基因工程抗体主要包括嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、单链抗体、双特异性抗体等。（1）嵌合抗体嵌合抗体（ chimeric atibody ）是最早制备成功的基因工程
12、抗体。它是由鼠源性抗体的 V 区基因与人抗体的 C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。（2）人源性抗体 是将人抗体的 CDR 代之以鼠源性单克隆抗体的 CDR ，由此形成的抗体，鼠源性只占极少，称为人源化抗体。（3）完全人源化抗体 采用基因敲除术将小鼠 Ig 基因敲除，代之以人 Ig 基因，然后用 Ag 免疫小鼠，再经杂交瘤技术即可产生大量完全人源化抗体。（4）单链抗体是将 Ig 的 H 链和 L 链的 V 区基因相连，转染大肠杆菌表达的抗体分子，又称单链 FV （ single chai
13、n fragment of variable region,sFv ）。 SFv 穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。（5）双特异性抗体 将识别效应细胞的抗体和识别靶细胞的抗体联结在一起，制成双功能性抗体，称为双特异性抗体。如由识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞（ CTL 细胞、 NK 细胞、 LAK 细胞）表面分子的抗体（ CD3 抗体或 CD16 抗体）制成的双特异性抗体，有利于免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用。20.抗体治疗药物有哪些？（1）放射性同位素标记的抗体治疗药物（2）抗癌药物偶联的抗体药物（3）毒素偶联的抗体药物21.抗体诊断试剂有哪些类型？（1）血清学鉴定用的抗体试剂（2
14、）免疫标记用的抗体试剂（3）导向诊断药物（4）CD单克隆抗体系列22. 单克隆抗体制备的基本原理与过程？有什么意义？答：原理：B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。过程：1）免疫脾细胞的
15、制备：制备单克隆抗体的动物多采用纯系 Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。2）骨髓瘤细胞的培养与筛选：在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。3）细胞融合的关键： 1、技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2、融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。4）阳性克隆的筛选：应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能
