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1、1/56,第11章 色谱分析法,http:/ 色谱法的发现,俄国植物学家茨维特在1901年用于分离植物叶绿素的装置,1. 概述,碳酸钙,石油醚,植物色素,3/56,色谱分析基于物质的物理性质进行分离和分析的方法。,色谱法是一种分离方法，其特点为存在两相,流动相携带试样混合物流过固定相的流体（气体或液体),固定相固定不动的一相,将色谱法用于分析中，称为色谱分析,碳酸钙,石油醚,1. 概述,4/56,样品混合物中各组分性质和结构的差异，与固定相发生作用的大小也有差异,1. 概述,碳酸钙,石油醚,流动相+样品混合物,固定相,产生相互的作用,不同组分在固定相中的滞留时间不同，按先后次序从固定相中流出实
2、现分离。,1.2 色谱法分离基本原理,5/56,1.3 色谱法的分类,1. 概述,按流动相状态的不同，可分为:,气相色谱法 (GC) 液相色谱法 (LC) 超临界流体色谱 (SFC),6/56,以气体为流动相的色谱法，简称GC（Gas Chromatography）,应用范围：用于分离分析易汽化（在-190 500范围内有0.210mmHg的蒸气压）、热稳定、不易分解、不易反应的样品，特别适合用于同系物、同分异构体的分离。,气固色谱(GSC) 气液色谱(GLC),按固定相状态分为,1. 概述,1.3.1 气相色谱法,7/56,1.3.2 液相色谱法,以液体为流动相的色谱法，简称LC（Liqui
3、d Chromatography）。,应用范围：用于分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。,1. 概述,8/56,1.4 色谱分析仪器基本流程,气相色谱仪,1. 概述,9/56,液相色谱仪,1. 概述,10/56,流动相携带进样装置引入的混合试样进入色谱柱 混合试样在色谱柱中进行分离 各组分依次进入检测器检测 检测响应信号导入计算机 得到色谱图 根据色谱图参数进行定性定量分析,流动相,进样 装置,色谱柱,检测器,数据记录与处理,样品,1.4.1 色谱分析仪器基本流程,1. 概述,11/56,1.5 色谱法的特点 :,优点：,分离效能高,选择性好,灵敏度高,分析速度快,应用广泛,不足之处：,定
4、性能力不强,分离，分析双重功能,1. 概述,12/56,关于色谱峰 关于保留值 关于峰宽度 关于色谱曲线的意义,2.1 色谱相关术语,2、色谱法基本理论,13/56,2.1.1 关于色谱峰的术语,色谱峰,峰高,基线,峰宽,半峰宽,峰面积,标准偏差,2、色谱法基本理论,14/56,(1) 色谱流出曲线,组分浓度（或电信号）随时间的变化曲线,(2) 基线,只有流动相经过检测器时，所产生的信号，反映实验条件的稳定情况。稳定时为直线。,E,正态分布 定性、定量 分离效果显示,基线,2、色谱法基本理论,15/56,2.1.2 关于保留值的术语,（1） 用时间表示的保留值,tR保留时间：进样柱后出现Cma
5、x值时所需时间,tM死时间:,不与固定相作用的组分的保留时间,t R 调整保留时间:,t R =tR - tM,进样,空气峰,16/56,（2）用体积表示的保留值,VR保留体积 :,VR = tRqv,0,V R调整保留体积: VR=VR-VM,VM死体积： VM = tMqv,0,进样,空气峰,qv,0为柱出口处的载气流速, mLmin-1,17/56,（3）相对保留值 r21,r21 同种固定液对难分离物质对的选择性度量,在气相色谱中， r21的大小仅与固定相种类和柱温有关。在液相色谱中， r21与固定相、流动相及柱温有关。 r21是色谱定性的重要参数，实验室之间可通用。,r21 越大，两
6、组分分离越容易,2、色谱法基本理论,18/56,2.1.3 关于色谱峰区域宽度的术语,（1）标准偏差（）：0.607h处峰宽的一半,反映分离条件的好坏，衡量柱效率,（2）半峰宽（Wh/2）：峰高1/2处的峰宽,A,B,W=4,Wh/2=,（3）峰底宽度（W）：自色谱峰两侧的转折点所作 切线在基线上的截距,2、色谱法基本理论,19/56,2.1.4 色谱曲线的意义 色谱峰数=样品中单组分的最少个数； 色谱保留值定性依据； 色谱峰高或面积定量依据； 色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。,2、色谱法基本理论,20/56,2.2 色谱分离的定量指标
7、分离度,色谱分离的效果：,2、色谱法基本理论,21/56,分离度R,上式既反映峰间距也反映峰宽的情况，利用此式，可直接从色谱流出曲线上求出R。,定义：相邻两组分色谱峰保留值之差与两个组分色谱峰峰底宽度总和之半的比值。,2、色谱法基本理论,22/56,理论上证明: 对于峰形对称的色谱峰,R=1 ，分离程度可达98%,R=1.5，分离程度可达99.7%,R=0.75，不完全分离,R=1.5 通常用作是否分开的判据,2、色谱法基本理论,23/56,要改善物质对的分离（提高R），即提高两相邻物质的分离度，增大r21 是最有效的手段。,在气相色谱中，增大r21最有效的手段是改变固定相，选择合适的固定相种
8、类是解决分离问题的关键。 在高效液相色谱中，流动相的种类和配比是改善分离最简便有效的方法。,改变柱温也可改变r21。,2、色谱法基本理论,24/56,2.3 色谱定性定量方法,2.3.1 定性分析,(1) 利用保留值定性,利用加入法定性：在试样中加入待测组分的纯物质，观察组分色谱峰高的相对变化情况。,各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，故可作为定性指标。 利用纯物质对照定性 利用文献值对照定性（很少用）,2、色谱法基本理论,25/56,26/56,应用范围：适用于简单混合物，对该样品已有了解并具有纯物质的情况。 优点：应用简便，不需要其他仪器。 缺点：定性结果的可信度不高。 提高可信
9、度的方法：双柱、双体系定性,2、色谱法基本理论,27/56,(2) 与其他方法结合定性,混合物经色谱分离后，将各组分直接由接口导入其它仪器中进行定性。常用的联用方法有：GC-MS、GC-FTIR、LC-MS 使用范围：复杂样品的定性。 优点：不需要标准物，定性结果可信度 高，操作方便。 缺点：需要特殊仪器或设备。,2、色谱法基本理论,28/56,2.3.2 定量分析的方法,(1) 定量依据 :,(2) 定量步骤 :,A) 峰面积(Ai)的测定和计算,B) 定量校正因子测量与计算,C) 选择合适的方法计算组分含量,mi=fi .Ai,在一定色谱条件下，被测物质的量与峰面积成正比。,定量校正因子,
10、2、色谱法基本理论,29/56,A）各种峰面积的测量方法,峰高半峰宽 Ai=1.065hY1/2,简单快速,峰形不 对称时，误差较大,峰高平均峰宽 Ai=1/2(Y0.15+Y0.85) h,结果正确, 测量麻烦,峰高保留时间 Ai=hY1/2=h b tR,结果较正确,适用 于同系物分析.,用自动积分仪 和色谱工作站,快速,简便 定量准确,2、色谱法基本理论,30/56,B）定量校正因子的测量与计算,绝对定量校正因子（fi）,指单位峰面积相当的物质量,相对定量校正因子（fi）,下标 s：标准物 下标 i：被测物,ms 和 mi 准确称取的量（已知）,As 和 Ai 色谱图上测得的值,2、色谱
11、法基本理论,31/56,C）计算组分含量的几种方法,归一化法,适用条件 ：,试样中各组分全部出峰,计算公式 ：,评价 ：,2、色谱法基本理论,32/56,适用条件：,用于测定试样中个别组分,具体方法：选用一定量的纯物质作内标 （内标物要求试样中不存在的，ms mi ，内标物的峰应位于被测组分峰之间或邻近位置。）,计算公式 ：,评价 ：,不需要测校正因子，定量准确，使用无限制。不适应于快速控制分析,内标法,2、色谱法基本理论,33/56,适用条件 ：,大批量试样的快速分析,具体方法：,取被测试样的纯物质，制成一系列不同浓度的标准系列，测得相应的峰面积，作AiCi%的工作曲线图。在相同条件下，测定
12、试样Ai，由图查出相应的Ci% 。,计算公式 ：,评价 ：,不使用校正因子，准确度高。对进样量的准确性要求高。,外标法,2、色谱法基本理论,34/56,3.1 气相色谱仪的流程,气路,色谱柱,进样,检测器,数据记录与处理,3、气相色谱法,35/56,1.载气系统 :,形成干净、有恒定压力和流速的载气流，包括气源、气体净化、气体流速控制和测 量,2.进样系统:,进样器和汽化室，汽化室可控制温度为20400,3.色谱柱:,完成样品的分离，包括柱箱、恒温控制装置,4.检测器:,将浓度或质量信号 电信号，包括检测器，控温装置,5.记录系统:,将电信号放大,记录出色谱图,经数据处理 得出结果，现用色谱工
13、作站,3、气相色谱法,气路,色谱柱,进样,检测器,数据记录与处理,36/56,3.2 分离原理,3、气相色谱法,气相色谱分离过程是在色谱柱内完成的。,3.2.1 分离原理,37/56,各组分性质和结构的差异，与固定相的作用力不同，使其保留时间不同。,气固色谱吸附能力不同而分离，与固定相作用力大，脱附难，随载气推进慢，后离柱， tR大。,气液色谱溶解能力不同而分离，与固定相作用力大，挥发难，随载气推进慢，后离柱， tR大。,3、气相色谱法,38/56,3.2.2 分配系数 K ：,定义：,试样在固定相和流动相中分配达到平衡时,特征：,T，固定相确定，不同物质的 K值不同。,K小 Cl 随载气移动
14、快，tR 小，先出峰,3、气相色谱法,不同组分能够分离的先决条件是其分配系数不等。两组分分配系数相差越大，两峰分离的就越好。,39/56,总结 :, 色谱过程的热力学因素,与试样组分在两相中的分配情况、试样本性及固定相有关。, 色谱过程的动力学因素,与试样在两相中的质量交换情况有关,气相色谱的分离原理： 不同物质在两相间具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，试样中的各组分在两相中进行反复多次的分配，使原来分配系数只有微小差异的各组分彼此分离开来。,3、气相色谱法,40/56,3.3 气相色谱固定相及其选择,有活性的多孔固体,支持物(担体)+固定液,3.3.1 气-固色谱活性多孔固体,固体吸附
15、剂 硅胶、氧化铝、碳质、分子筛等,高分子聚合物 以二乙烯基苯为单体交联聚合 而成的小球,3、气相色谱法,41/56,3.3.2 气-液色谱担体+固定液,提供一个大的惰性表面，承载固定液。,3）热稳定性好，有一定的机械强度,1）多孔性，表面积大，颗粒及孔径均匀,2）表面化学惰性，无吸附和催化性能,非硅藻土型担体,硅藻土型担体,红担体（天然硅藻土）,白担体（天然硅藻土 +CaCO3）,3、气相色谱法,担体,42/56,固定液：,(1) 要求,操作温度下，呈液态，粘度低；,挥发性小，热稳定性高；,能牢固地吸附在担体表面，形成均匀和结构稳定的薄层；,化学稳定性好，对组分有适当的溶解能力，并具有高选择性。,一般是高沸点有机物,3、气相色谱法,43/56,3、气相色谱法,(2) 固定液分类及其应用,44/56,(3) 固定液的极性,固定液的极性大小，关系到各组分在其的溶解能力。,极性的表示方式：,一般用相对极性（P）表示固定液的极性大小,3、气相色谱法,45/56,(4) 固定液的选择,“相似相溶” 的原则,非极性固定液,按沸点由低至高出峰,极性固定液,按极性由小至大出峰,中等极性 固定液,先非极性，后极性出峰,氢键型固定液,按氢键由弱至强出峰,特殊固定液,3、气相色谱法,46/56,3、气相色谱法,3.4 气相色谱检测器,
