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1、微生物的培养与应用,课题1 微生物的实验室培养,点此播放教学视频,微生物包括哪五类：,病毒 细菌 放线菌 真菌 原生动物,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,培养基可以分为哪几类？,培养基一般都含有哪些营养物质，此外 还要满足哪些要求？,获得纯净培养物的关键是什么？,避免杂菌污染的方法包括哪四个方面？,什么是消毒、灭菌，常用方法有哪些？,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法步骤？,如何倒平板？,一、培养基,二、无菌技术,点此播放教学视频,（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基和液体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、计数、鉴定菌落等。液体培养基常用于工业生产。 （2）按功能来分，可分为选
2、择培养基和鉴别培养基。 （3）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。,培养基分类：,1、培养基可以分为哪几类？,点此播放教学视频,选择培养基,:在微生物学中，将允许特定种类,的微生物生长，同时抑制或阻止其它种类微生物生长的培养基。,鉴别培养基,根据微生物的代谢特点在培养基加入某种指示剂或化学药品配制而成，用以鉴别不同的微生物,只起鉴别作用，并不能抑制其他微生物,点此播放教学视频,牛肉膏蛋白胨固体培养基配方,牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000ml。,根据配方你能配制出100ml培养基吗？,配方中的各成分为微生物
3、提供了哪些营养？,点此播放教学视频,固体培养基：菌落,点此播放教学视频,菌落,菌落是鉴定菌种的重要依据,点此播放教学视频,不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。,2、培养基一般都含有哪些营养物质，此外 还要满足哪些要求？,培养基的营养物质,点此播放教学视频,3、获得纯净培养物的关键是什么？,4、避免杂菌污染的方法主要包括哪四个 方面 ？,5、什么是消毒、灭菌，常用方法有哪些？,二、无菌技术,点此播放
4、教学视频,消毒与灭菌,消毒：使用较温和的物理或化学方法仅杀死物 体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不 包括芽孢和孢子）。 灭菌：使用强烈的理化因素杀死物体内所有的 微生物，包括芽孢和孢子。,灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。,点此播放教学视频,消毒的方法：,煮沸消毒法: 100煮沸5-6min 巴氏消毒法: 70-75 下煮30min或 80 111111111111下煮15min 化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭111111111111111等进行皮肤消毒;氯气消111111111111111毒水源 紫外线或化学药物消毒,点此播放教学视频,灭菌的方法：,1、灼
5、烧灭菌 2、干热灭菌：160-170 下加热1-2h。 3、高压蒸汽灭菌：100kPa、 121 下维持15-30min.,点此播放教学视频,6、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法步骤,7、如何倒平板？,点此播放教学视频,二、实 验 操 作,（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,1.牛肉膏蛋白胨固体培养基配方,2.称量 按比例称取各种物质，注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。,点此播放教学视频,3.溶化：先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解
6、，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加蒸馏水定溶至100mL。,4.灭菌(先调PH)将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），放到高压锅内灭菌；培养皿（用几层报纸包好）放入干热灭菌箱内灭菌。,5.倒平板：待培养基冷却到50OC左右时倒平板（如教材17图示）。,点此播放教学视频,点此播放教学视频,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,倒平板讨论,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,点此播放教
7、学视频,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,点此播放教学视频,（二）纯化大肠杆菌,微生物接种方法常见的有平板划线法和稀释涂布平板法。,1.平板划线法 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面（操作
8、如教材18页图示）。 在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称菌落。,点此播放教学视频,操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后仍然要灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,1、为什么在操作的第一步以及划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环？,点此播放教学视频,2.在灼烧接种环之后，为什么
9、要等其冷却后再进行划线？ 3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,以免接种环温度太高，杀死菌种。,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,点此播放教学视频,微生物的恒温培养,2.稀释涂布平板法 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。 稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。,点
10、此播放教学视频,涂布平板操作,(1)将涂布器浸在盛有70的酒精的烧杯中。,(2)取少量菌液（不超0.1mL），滴加到培养基表面。,(3)将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷却810s。,(4)用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。,点此播放教学视频,点此播放教学视频,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,点此播放教学视频,原理：培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物
11、由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,（一） 筛 选 菌 株,点此播放教学视频,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,选择培养基,（二） 统计菌落数目,1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量,缺点,不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数,点此播放教学视频,（1）常用方法：,通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大 约含有多少活菌。,（2）原理
12、：,稀释涂布平板法。,2.间接计数法（活菌计数法）,点此播放教学视频,二.实验的具体操作 .土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 .制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,点此播放教学视频,应在火焰旁称取土壤10g。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,三样品的稀释,点此播放教学视频,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培
13、养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,点此播放教学视频,注意事项 为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。 为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。,微生物的培养与观察,点此播放教学视频,三.结果分析与评价 1.通过对照实验
14、，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。 2.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。,点此播放教学视频,三、课 题 延 伸,能分解尿素的细菌的鉴定,鉴定的原理： 细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，会使培养基的pH升高。 鉴定方法： 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，利用此培养基进行细菌培养，观察培养基的颜色变化。,点此播放教学视频,分解纤维素的微生物的分离,（一）纤维素与纤维素酶,纤维素：一种由葡萄糖首尾相连而
15、成的高分子化合物，广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。,纤维素酶：由微生物分泌的一种复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用，最终将纤维素分解成葡萄糖。,点此播放教学视频,刚果红染色法,刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。,用加入刚果红的纤维素培养基去培养微生物时，如果培养基中出现以菌落为中心的透明圈时，可说明该菌落是纤维素分解菌，因为它已将被刚 果红 染成红色的纤维素分解了。,原理,点此播放教学视频,3.刚果红染色法分离：常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。,优缺点,点此播放教学视频,优点与不足,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,操作繁琐 刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便不存在菌落混杂问题,1.产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈 2.有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,
