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1、,基因测序技术 蔡悦,1,DNA双螺旋1953 中心法则1958,PCR 1983,DNA重组技术1974,遗传密码1966,DNA是遗传物质 1952,1950,2000,1990,1980,1970,1960,2010,第一台自动测序仪1986,毛细管电泳测序仪1996,荧光ddNTP第一台商用自动测序仪1987,化学降解法和sanger 1977,Illumina 2006,3700 1998,Solid system 2007,454 2005,Heliscope 2008,Nanopore 2008,Smrt 2009,2,第一代基因测序技术,1977年桑格测定了第一个基因组序列，是
2、噬菌体X174的，全长5375个碱基 在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础,1.1975年由（Sanger）和（Coulson）开创的双脱氧链终止法 2.1977年吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解） 3.在sanger法基础上发展而来的各种DNA测序技术,3,Sanger法的原理,1.使用带有放射性同位素的ddNTP来终止DNA合成反应 2.高分辨率变性凝胶电泳以及放射自显影确定DNA序列,核心原理：,1.测序长度可达1000bp 2.准确性高，几乎100% 3.通量低，成本高，耗时长，不适合大规模应用,特点：,Sanger法核心原理,4
3、,第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用,如人类基因组计划(human genome project,HGP)主要基于第一代DNA测序技术。目前基于荧光标记和Sanger的双脱氧链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用。,随着人类基因组计划的完成,人们进入了后基因组时代,即功能基因组时代,传统的测序方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求,这促使了新一代DNA测序技术的诞生，即第二代测序技术。,5,第二代基因测序技术,核心原理：边合成边测序（SBS）,基本步骤：文库制备单克隆DNA簇的产生测序反应,6,具代表性的第二代测序平台： 1.荧光标记 -美国Illumin
4、a 公司的基因组测序仪（genome analyzer，GA） -瑞士Roche 公司的454 -美国ABI 公司的寡聚物连接检测测序（sequencing by oligo ligation detection， SOLiD）,第二代基因测序技术,2.PH变化 -美国Life Technologies 公司的Ion Torrent个人化操作基因组测序仪(PGM）,7,Illumina测序平台,美国Illumina 公司的基因组测序仪（genome analyzer，GA）,Illumina的Solexa和Hiseq是目前全球使用量最大的第二代测序机器,主要技术点： 1.可逆终止的荧光标记dN
5、TP 2.边合成边测序,8,Illumina测序平台测序原理,文库构建,SBS测序,桥式pcr,Flowcell,测序原理（来自illumina官网）,9,Illumina测序平台核心部件,测序流动槽flowcell：吸附流动DNA片段的槽道，也是核心的测序反应容器在flowcell上进行DNA簇的生成，测序。,Flowcell实物图,10,Flowcell表面示意图（来自illumina官网）,每个泳道(Lane)内的上下两个表面随机的布满了能够与文库两端接头分别互补配对的寡核苷酸(P7和P5接头)。这两种接头与泳道表面共价连接。,Flowcell表面微观示意图,11,DNA文库制备,A,A
6、,T,T,片段化DNA,末端补平,3加A： 加一个A,接头连接,A,完成文库构建,12,DNA模板杂交和一链合成,5-3 延伸,接头序列,含有P7和P5两种接头 的FlowCell表面,2.以杂交的单链DNA为模板，FlowCell上的接头为引物， 合成第一链,1.单链DNA分子与FlowCell表面的对应接头杂交,13,双链DNA变性,变性,冲走模板链,新和成的链留在flowcell上,14,桥式PCR的扩增,单链DNA与FlowCell表面对应接头杂交，形成“桥”,以接头为引物进行扩增,扩增完成形成双链的桥,15,双链DNA变性,变性,得到与FlowCell相连的两条互补的单链DNA分子,
7、16,待测链形成,完成数十次循环的桥式PCR,变性：双链“桥”变性为单链,P5上的切割位点,切割并冲走与P5接头相连的那条DNA链,将测序引物杂交到文库的接头上，并且封闭3-OH端,17,SBS测序,特异荧光标记的4种dNTP，3-OH叠氮基团被保护，每次只能添加一个dNTP，这就确保了在测序过程中，一次只会被添加一个碱基，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。,边合成边测序（来源：illumina官网）,Ion Torrent PGM半导体测序,PGM测序原理,芯片就是测序仪，4种dNTP依次流过半导体芯片PCRDNA聚合产生的氢离子直接检测，每个碱基只需数秒,18,19,测序成本比较
8、,1.高通量，成本降低，敏感性高 2.简单快速自动化 3.读长较短50-300bq左右 4.PCR可能引入偏倚跟错配,如： 以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周。,第二代测序技术特点,第三代测序技术,20,具代表性的第三代测序平台： 1. Pacific Bioscience 公司的单分子实时测序(Single molecule real time sequencing，SMRT) 2. Oxford Nanopore 的纳米孔单分子技术,第二代的高通量测序技术已经得到了很好的发展和应用, 但是由于其测序速度、成本、准确度等关键问题的解决仍存在困难,研究者
9、们很快将目光转向了更高更新的测序解决方案。 单分子测序也就应运而生。,21,Oxford Nanopore纳米孔单分子技术,Oxford Nanopore 的纳米孔单分子技术,Oxford Nanopore 的纳米孔单分子技术采用边解链边测序的方法。无需合成，为真正的单分子测序。,当单链DNA模板会被核酸外切酶剪切成一个个碱基通过纳米孔，此时由于碱基的不同，检测到的电流强度也不同，反映出DNA模板链的碱基排布。,Oxford Nanopore纳米孔单分子技术,MinION,英国Oxfold Nanopore Technologie公司现已推出高通量的GridION （2012 年） 和U盘大小的MinION （2013年）测序，它们均处于试用阶段。,22,23,第三代测序技术特点,1.在第二代基础上增加读长，达到5000bp以上，甚至数十kb 2.单分子测序，样品处理简单避免了扩增可能引入的错配，准确率接近100% 3.能直接对RNA和甲基化DNA序列进行测序,谢谢,
