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1、第六章 微生物生长与控制,主讲人：纪铁鹏 第八节 微生物的纯种分离,自然界中微生物种类繁多，而且绝大多数混杂在一起的，有时微生物的纯种在接种、培养等过程中由于操作不当也会被污染，为了得到微生物的纯种，必须把所需的微生物从混杂的微生物中分离出来，这就是在无菌技术的基础上微生物学的另一项基本技术纯种分离技术。分离的一般过程如下：,一、采样,如果从环境中分离微生物，首先的工作就是采样，如果是培养的微生物被污染了则可以直接进行分离。采样首先要根据微生物的生活习性，选择合适的采样地点。如分离酵母菌在果园的土壤里较易找到，分离乳酸菌在酸牛乳中较易找到。采样后最好马上进行分离，以防染菌或样品中的菌发生变化。
2、,二、增殖培养,有时样品中要分离的目的微生物很少，就要设法增加该菌种的数量，以增加分离机率，这种人为增加微生物数量的方法叫增殖培养，对于特别少的微生物可进行多次增殖。 增殖培养时要求不需要的微生物缓慢增殖或几乎停止增殖，而所需微生物类型经增殖后数量上占优势，便于分离，这就需要控制培养条件。,（一）、控制培养基营养成分,营养成分主要指碳、氮、无机盐及维生素等。各种微生物对物质的要求是有差异的。异养型微生物只能利用有机碳源，如葡萄糖、蔗糖等糖类及纤维素、淀粉类碳水化合物或烃类等，自养型微生物可能以CO2为碳源。,微生物能利用的氮源可以是蛋白质大分子，如酪蛋白、豆饼粉、麸皮，或其水解得到的小分子，如
3、蛋白胨、多肽、氨基酸水解液及尿素等有机氮化合物，也可是硝酸盐、铵盐或氨态的无机氮源，固氮微生物能直接利用空气中的氮。,实际上往往按照各大类微生物确定基本的营养成分，如细菌用蛋白胨、牛肉膏，放线菌用淀粉，酵母、霉菌用麦芽汁或米曲汁等。,（二）、控制培养基酸碱度,各种微生物生长繁殖的适宜酸碱度是不同的，细菌和放线菌一般要求中性或偏碱性（pH7.0或稍高）；酵母菌和霉菌一般要求偏酸性（pH4.06.0）。在控制营养成分的同时，将培养基调至一定的pH值，更有利于抑制不需要的微生物的增殖。,必须说明，用控制pH值使不同的微生物获得不同的生长速度的方法是有局限性的，酵母、霉菌喜爱微酸性环境，但在中性条件下
4、也能良好生长。细菌一般不耐酸，但有些细胞也能在pH值6以下生长。这里指的酸碱度是培养基配制时的起始pH值。,在微生物生长过程中，由于糖代谢产生有机酸，氨基酸分解产生氨，铵盐利用留下酸根等均造成pH的变化。因此为保持培养基处于适宜的pH范围，可以在培养基中加入缓冲剂。常用的是磷酸盐，同时也作为磷源，微生物能忍受约5g/L 的磷酸盐，过高时有抑制作用。培养过程中，当pH值下降很剧烈，以致加缓冲剂也很难以维持时，可用不溶性碳酸盐如碳酸钙，它与酸反应可释放出CO2而缓冲pH的下降，不能使用CaCO3时需用补加酸、碱的方式来调节。,（三）、控制培养温度和热处理,不同种类的微生物，适宜的生长温度是不同的，
5、利用不同培养温度可使不同的微生物生长速度不同。如在30左右时嗜冷微生物可能不能生存，而嗜热微生物则生长缓慢。为了获得耐高温的酶，可寻找高温细菌，采用5060温度培养，就可使嗜冷、嗜温微生物大量淘汰，嗜热微生物占优势。即使同为嗜温微生物，提高培养温度可筛选耐热的菌株，有利于发酵工业节约冷却用水。,芽孢是特别耐热的，可以抵抗100或更高的温度。因此可根据这点，将样品悬浮液经80水浴中处理10min，将不产芽孢的营养细胞杀死，从而达到浓缩产芽孢的菌种的目的。,（四）、添加抑制剂,添加专一性抑制剂，也可达到抑制不需微生物增殖的目的。如土样悬浮液中加数滴10%酚，可抑制霉菌和细菌的生长，而放线菌仍能较好
6、的生长；又如添加青霉素、链霉素之类抗生素，能抑制细菌的生长。不同抗生素能抑制的菌类的范围不同，所用浓度等也不同，应区别分离对象及药物性质添加适当量。,三、分离,分离操作是微生物实验中一项重要的操作。有时一次分离操作达不到分离效果，这就需要反复几次进行分离，直到得到目的微生物的纯培养物为止。分离微生物时常采用以下几种方法：,（一）、稀释平板法,本法是通过将样品制成一系列不同的稀释样，使样品中的微生物个体分散成单个状态，再取一定量的稀释样，使其均匀分布于固体培养基上，培养后挑取所需菌落，重新培养，即可得到所需微生物。,首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一
7、个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物. 这种方法适合于细胞较大的微生物.,液体稀释法,倾注平板法（Pour Plate）,Organisms are serially diluted, then a small amount is added to an empty sterile petri dish, to which melted agar at 50 C is added. Then mix to distribute the organisms.,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,1m
8、l,9ml,9ml,9ml,9ml,（二）、涂布平板分离法（Spread Plate）,简单易行，但易造成机械损伤,（三）、划线平板分离法（Streak Plate）,特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）,平板划线方法,a-扇形划线法 b-蜿蜒划线法 c-连续划线法 d-平行划线法,连续划线,划线分离后平板上显示的菌落照片,选择性培养分离法,为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。,利用选择培养基进行直接分离 富集培养,（四）、单细胞（单孢子）分离法,前述的方法不
9、能有目的的选取所需要的微生物个体，现在还可以采用显微技术，通过显微挑取器选出所需的微生物细胞或孢子。 具体的方法是把显微挑取器安装在显微镜上，用极细的毛细管或显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子。若没有显微操作仪时，也可以把菌液多次稀释，把一小滴放在显微镜下观察，选取只含一个细胞的该液滴进行培养，可得到分离效果。,（四）、单细胞（单孢子）分离法,采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。,小液滴法：,将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。此法要求一定的装置，操作技术亦有一定的难度，多限于高度专业化的科研中采用。,思考题,名词解释： 灭菌 消毒 防腐 共生关系 互生关系 寄生关系 拮抗关系 分批培养 纯培养 混菌培养 二原培养 同步培养 连续培养 恒浊连续培养 恒化连续培养 接种 增殖培养 致死温度,简答题：,1.请写出细菌的稀释倾注分离法的程序。 2.如何将杂菌中的细菌分离并加以鉴别。 3.请叙述微生物的接种方法。,
