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1、,重组与血源凝血因子的特点及研发进展,目 录,血源性F与重组F的特点,一、血友病A与凝血因子,血友病A（hemophilia A，HA） 又称血友病甲，是一种X染色体连锁的凝血因子量和分子结构异常引起的隐性遗传性出血性疾病，临床特点为“自发性”关节出血和深部位组织出血。,一、血友病A与凝血因子,凝血因子（coagulation factor ，F ） F基因位于X 染色体长臂末端(Xq28)， 长为186kb，由26个外显子组成，其中第l4号外显子为3.1 kb，是目前发现的人类最大的外显子之一F mRNA长9kb，编码一条由2351氨基酸组成的前体多肽。,成熟蛋自由2332氨基酸组成氨基酸顺
2、序分析表明，F 蛋白由3个A 结构域，一个B结构域及2个C结构域组成； 从血浆中及从重组细胞培养上清中分离纯化得到的F 是由两条肽链所组成， 二条肽链间由Ca2+连接； 目前的研究表明，B结构域对F的凝血活性并非必需。,二、血源性F与重组F的特点,F在血浆中含量极微， 0.05-0.1g/ml；,我国血友病患者病毒感染情况不容乐观,钟小红对中国血友病协作组的215名4-18岁各型血友病患者，其中119例患者进行了感染相关性病毒的检测；HBV、HCV和HIV的感染率分别为2.5%、10.1%和3.4%6,1.周釥民等.中国预防医学杂志 2001年3月第2卷第1期；2.杨仁池. 中国实用内科杂志2
3、008年10月第28卷第10期. 3.丁培芳等血栓与止血学.2002;8(3).；4.李钦伟等. 山东医药2007年底47卷第16期 5.张雪芹，张心声等. 中国艾滋病性病2012年10月第18卷第10期. ；6.钟小红.护理学杂志.2010;25(11):3-26,病毒感染,80年代，在浙江省发现4例血友病患者因使用进口FVIII浓缩制剂而感染艾滋病1，为此中国政府禁止进口血制品,2007年，李钦伟等报道，224例输注冷沉淀或凝血因子VIII制剂的血友病A患者的抗HCV阳性率高达27.3%4,据不完全统计, 我国血友病患者感染HIV已经超过190例2,丁培芳等对山东省19922000年确诊和
4、治疗的162例血友病A患者的病毒感染情况进行调查分析，结果显示血友病A患者抗-HCV阳性率为20.73%3,张雪芹等报道的血友病A患者的抗HCV阳性率相比过去已经有了显著下降，但是其感染率仍显著高于无偿献血者，尤其是年龄在4077岁的患者，抗HCV感染率仍高达20.5%5,血源性F制剂存在的问题,血源性F制剂病毒感染的对策,20世纪70年代末开始了供血者的病毒检测以及血源性F的病毒祛除和灭活研究。 80年代推出了多种病毒灭活方法： 干热法 有机溶剂/表面活性剂法（S/D法） S/D法+干热法（SDH法） S/D法+纳米膜过滤法（SDN法）,干热灭活： 采用80，72h加热灭活，该法能十分有效地
5、灭活HIV坏人肝炎病毒，但对无脂包膜的耐热B19细小病毒无效 如果采用高热处理，如 100，持续30min对无脂包膜病毒有良好的灭活效果,有机溶剂/表面活性剂(S/D)灭活： 在F浓缩物中加入有机溶剂(如磷酸三丁酯，氯仿等)和表面活性剂(如胆酸钠、吐温-80，Triton X-100等)以灭活病毒 S/D灭活法条件温和、不需要特殊设备 S/D的配伍作用能破坏病毒的脂包膜、从而灭活病毒、而对蛋白质的结构和功能几乎无影响 该法对无脂膜的病毒灭活效果不佳,目前公认的、比较有效的病毒灭活方法有干热灭活、有机溶剂/表面活性剂(S/D)处理法等，WFH最新发布的注册认可在全球上市的优良制剂，所采用的病毒灭
6、活工艺大多结合了干热灭活和S/D两种方法。,1.张献清,等.药学进展.1997;21(1):26-19. 2. http:/www.raas- 1997年全面禁止未经病毒灭活处理的血液制品的应用； 2002年要求血源性F制剂的制备工艺必须要有2种以上病毒祛除/灭活方法。,血源性F制剂工艺,凝胶过滤法 离子交换层析法 亲和层析,低温乙醇法 甘氨酸沉淀法 PEG分段沉淀法 PEG-甘氨酸分段沉淀法 酸沉淀法,冷沉淀工艺,纯化工艺,病毒灭活,干热法 S/D法 SDH法 SDN法,血源性F仍存在安全隐患,国内血源性F制剂供不应求,1.血友病.杨仁池主编.上海.上海科技出版社.2007. 2.http:
7、/www.xueyou.org/china/xinwen/xy/201305/1116.shtml. 3.赵同利.人凝血因子紧缺现状及对策探讨.2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集.,血源性FV来源于原料血浆的纯化分离1 我国多次出现血源性FV产品短缺2,3,血源性F（200IU/瓶） 2010年 177857瓶 2011年 348600瓶 2012年 263708瓶 2013年 395508瓶 2014年 506984瓶,重组凝血因子制剂的诞生,1984年F cDNA由美国遗传研究所克隆成功，并在哺乳动物细胞中表达，从而开始了重组凝血因子（rF）的研制工作； 1988年rF获准进行
8、临床试验； 1989年首次报道了应用rF成功治疗一例重型HA患者。,重组凝血因子制剂的发展,1992 2000 2000 2003 2008 2013,拜科奇的四步生产工艺,拜科奇连续灌注发酵技术获得生物化学奖,连 续 灌 注 发 酵,生物化学奖,Boedeker BG. Semin Thromb Hemost. 2001;27(4):385-394.,重组凝血因子制剂的优点,安全性相对较高；但理论上通过血液制品，包括真核细胞培养过程中应用的牛胰岛素及胎牛血清等途径感染病原体的可能性是存在的。 可获得性显著提高； 可改造性明显提升；通过分子改造可以延长其清除半衰期，从而达到减少给药次数、长效的
9、目的。,重组凝血因子制剂存在的问题,免疫原性 抑制物产生率 药代动力学影响,重组制品中含有的微量杂质（如宿主细胞蛋白和工艺过程所用的鼠源单抗的残留等）以及缺乏内源性辅因子（如某些重组制品缺乏VWF）是导致这些问题的可能原因。,三、我国F产品概况与研发热点,适应症,贮存条件,三种产品均是在2-8下保存，禁止冷冻。,1.拜科奇注射用重组人凝血因子VIII说明书 2.百因止注射用重组人凝血因子VIII说明书 3.任捷注射用重组人凝血因子VIII说明书,药代动力学特征-拜科奇,儿童的拜科奇药代动力学参数,拜科奇说明书,在北美20例严重血友病A PTPs患者(12岁到22岁之间)中进行，单剂量给与KOG
10、ENATE，50IU/kg，24周后，对相同患者，给予相同剂量的拜科奇，继续治疗24周,药代动力学特征-百因止,100例10岁的中重度血友病A患者(因子VIII2%)药代动力学结果,53例6岁以下中重度血友病A患者药代动力学结果,百因止说明书,药代动力学特征-任捷,既往接受过治疗的甲型血友病患者基线和6个月随访的药代参数,AUC,药时曲线下面积，从零趋近于无穷大；Cmax ：峰浓度 K值：活性恢复增量； T1/2：血浆清除率半衰期；CL：清除率 SD：标准差,任捷说明书,7例接受过治疗的1216岁患者的药代动力学与成人的相似,2009年拜耳与中华慈善总会共同启动了 “拜科奇儿童血友病患者援助项
11、目” 援助模式为,项目截至目前在全国共设了35个发药点，在121家医院151名注册医生的帮助下，援助共计1500人，累计援助金额1.19亿元。,患者 自费,根据患者购买拜科奇药品票据给予10%的资金援助，每年援助资金设有上限： 未成年人：15000元/年 成年人：20000元/年,根据患者困难程度及经济负担状况，给予不等金额的资金援助。,医保报销大部分用药费用,2015年拜耳与中华慈善总会共同启动了 “拜科奇co-pay援助项目”,现有拜科奇救助项目实现全人群覆盖,长效重组F的研发,长效VIII因子是目前血友病A治疗药物研发的焦点之一，有可能增加采用预防治疗的患者数量，提高患者的依从性，改善患
12、者预后1 聚乙二醇化是正在开发的延长FVIII半衰期的最常见技术,http:/www.wfh.org/en/abd/prophylaxis/current-issues-in-prophylaxis 1. Mei, et al. Blood. 2010;116(2):270-279 2. Yoshioka, et al. Chem Cent J. 2011;5:25,聚乙二醇化(PEG化)是长链、化学活化的PEG分子共价连接至治疗药物2 PEG化可提高治疗效果和/或耐受性通过3 减少肾的清除和蛋白水解机制(因此增加半衰期) 降低免疫原性,组织,受体,PEG化蛋白,天然蛋白,抗体,蛋白酶,聚乙二
13、醇,肾小球滤过,研发中的聚乙二醇化rFVIII产品,BDD=B区结构缺失; BHK=幼仓鼠肾细胞; CHO=中国仓鼠卵巢; FL=全长,Coyle, et al. J Thromb Haemost. 2014;12:488-496 Turecek, et al. Hmostaseologie. 2012; 32 (Suppl 1):S29S38 Coyle TE,et al.J Thromb Haemost.2014 Apr;12(4):488-96. P. L.Turecek,et al.Haostaseologie.2012; 32 (Suppl 1):S29S38.,BAY 949027
14、半衰期显著延长,期临床试验结果： BAY94-9027与rFVIII-FS相比t1/2延长，约为19小时，重复给药8周后t1/2变化不大(多达16ED) ，单次或多次给药后Cmax和AUC呈剂量依赖性,Coyle TE,et al.J Thromb Haemost.2014 Apr;12(4):488-96.,BAY 949027安全性良好,BAY949027期临床研究期间安全性良好,Coyle TE,et al.J Thromb Haemost.2014 Apr;12(4):488-96.,安全性,无治疗相关不良反,仅一例严重不良反应：骨盆肌肉出血,耐受性良好，无抑制物产生,III 期研究研
15、究显示：BAY 94-9027的安全性和耐受性良好,受试者接受了长达36周的BAY 94-9027治疗,证实未产生因子VIII抑制物,1992 2000 2000 2003 2008 2013,NovoEight,turoctocog alpha，该药是诺和诺德第三代重组FVIII，利用了最新的基因重组及蛋白纯化技术，用于A型血友病患者出血事件的预防和治疗。 NovoEight已在III期Guardian项目中进行了评价，这是迄今为止在A型血友病患者中开展的最大的临床预注册试验项目，涉及超过200例A型血友病患者。 III期临床试验包括既往接受过治疗的重度A型血友病成人及儿童患者，研究结果证明
16、了turoctocog-alpha对出血事件的预防及治疗疗效，同时患者体内未产生抑制剂。,Obizur,成分：重组F，猪序列，用于获得性血友病A（AHA）的治疗。AHA是一种极罕见、可能危及生命的急性出血性疾病；由于循环血中存在抗人F自身抗体而使得重组或血源人F产品输注无效。Obizur因为不受抗人F抗体的影响而起到预防和治疗出血的作用。 FDA批准日期：2014年10月23日 生产公司：Baxter Healthcare Corporation,结语,F研究方向： 重组和血源F生产工艺研究 重组和血源凝血因子的分子差异及其药理药效学的影响的研究 目前的研究结果尚有诸多未能解开的疑问，特别是如何减少重组制品的免疫原性以及增强它们的疗效、安全性和使用方便性方
