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1、标记免疫自动化,Content,检测技术发光剂的种类,酶：半定量 放射性同位素：良好精密度、宽线性；难自动化，生物安全危害 荧光素：易受自身荧光物质的干扰 化学发光物质 鲁米诺：J&J 丫叮酯：Abbott-Architect，Siemens-Centaur 三联吡啶钌：电化学发光-Roche AMPPD：BCI，Siemens-Immulite,包被技术的进步,磁颗粒包被技术,微粒子 直径 0.08 +/- 0.02 mm 悬浮于微小反应体系中 50 - 100 mL 分析能力 极大的固相表面积 2.45 cm2 极大的分析物结合能力 50 - 1000 ng/cm 2,Beckman免疫检
2、测,UniCel DxI 800,Dioxetane 化学发光物质,发光底物在碱性磷酸酶作用下磷酸酯基发生水解，脱去一个磷酸基而得到一个中等稳定的中间体AMPD-，(半衰期230分钟)。此中间体分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子，当其回到基态时产生470nm的光，并可持续几十分钟。,BCI 分析步骤,2步,夹心法抗体检测,+,+,2步,夹心法抗体检测,Dioxitane-PO4,SIEMENS免疫检测,Immulite ADVIA Centaur XP（Bayer）,Immulite平台,夹心法 竞争法 间接法,免疫检测的基本原理,夹心法（Sandwi
3、ch Immunometric,direct； Immunometric assay）,*,Capture Ab,Ag,Labled Ab,Proportionality directly Complex formed capture Ab+Ag+Ab labeled Detection antigen,Primary Ab,Ag unlabled,竞争法 （ Competitive immunoassay）,免疫检测的基本原理,*,Ag labled,Tracer-ALP,Proportionality indirectly Detection Ag Complex formed Ab+Ag
4、,*,免疫检测的基本原理,间接法 （indirect Immunometric）,Ag,Ab in specimen,Anti-human IgG,Tracer-ALP,反应过程解释,IMMULITE试剂是基于固相的化学发光免疫方法。固相是基于聚苯乙烯材质的小园珠，包被有抗原或抗体，然后装入小的测试杯中。病人血清（含有待测项目的抗原或抗体）和碱性磷酸酶标记的试剂同时加入到测试杯中，在37度的环境中进行30分钟(或60分钟)的温育，并伴有间歇振荡。在这期间中，血清中抗原（或抗体）和试剂中的碱性磷酸酶标记的抗原（或抗体）与包被珠上的定量的抗体（和抗原）进行竞争（或夹心）结合反应。没有结合的反应物经
5、过离心后被分离出去。然后将底物加入，进行第二次温育。 化学发光底物（Chemiluminescent Substrate），又称为 金刚烷的磷酸酯，在有碱性磷酸酶存在的情况下发生水解（Hydrolysis）进入不稳定态。这种持续的不稳定使能量释放出来，能量以光子的形式释放出来。光电倍增管将释放的光子读取出来，然后根据标准曲线转换成浓度值。,ALP-AMPPD 反应系统,IMMULITE 包被珠技术,IMMULITE Test Unit,IMMULITE 2000 Reaction Tube,Same coated-bead technology used for both systems en
6、sures rapid menu expansion Preserves exquisite assay sensitivity on IMMULITE 2000 Provides for excellent correlation between IMMULITE and IMMULITE 2000,ADVIA Centaur XP（Bayer）平台,抗体 抗原 示踪剂 检测装置 分离,ADVIA Centaur XP（Bayer）,抗体： 结合抗原 特异性,抗体结合,抗体结合,抗体： 结合抗原 特异性 与AE发生共价结合,化学发光免疫,化学反应以发光形式释放能量,化学发光免疫用于标记,吖啶
7、酯,提供体积小的分子： 提升扩散速率 最大程度避免结合位点的遮蔽 提高分析灵敏度,碱性磷酸酶,哎啶酯,吖啶酯,一秒钟高强度的光释放使报告结果更快,吖啶酯直接化学发光法的优点,无需额外的信号放大或底物 光的释放快速 背景干扰最小,微磁颗粒,氧化铁颗粒被吸引至磁场区 与抗原或抗体发生共价结合,微磁颗粒(PMP),抗体,微磁颗粒,用于分离结合与未结合的反应物,磁场,未结合的AE,测定方法的反应模式,夹心结合法 竞争结合法 标记抗原 标记抗体,夹心结合法 步骤 1,AE-标记抗体加入样品中，与样品抗原结合,哎啶酯 (AE),抗体,样品中的分析 物特异性抗原,其它颗粒,夹心结合法 步骤 2,PMP-抗体
8、-抗原-抗体AE复合物,加入与特异性抗体结合的PMP，孵育，结合抗原的PMP再与 AE-标记抗体结合,夹心结合法 步骤 3,将未结合的AE分离并去除,夹心结合法 步骤 4,加入酸碱，启动化学发光反应，计算浓度,采用标记抗原的竞争结合法 步骤 1,AE-标记抗原与样品抗原竞争结合与PMP共价结合的有限的抗体 结合位点,采用标记抗原的竞争结合法 步骤 2,孵育后将反应混合物置于磁场下，分离并除去未结合的AE,采用标记抗原的竞争结合法 步骤 3,加入酸碱，启动化学发光反应，计算浓度,采用标记抗体的竞争结合法 步骤 1,结合抗原的PMP与样品抗原竞争AE-标记抗体上有限的抗原结合位点,采用标记抗体的竞
9、争结合法 步骤 2,孵育后将反应混合物置于磁场下，分离并除去未结合的AE,采用标记抗体的竞争结合法 步骤 3,加入酸碱，启动化学发光反应，计算浓度,测定方法的反应原理,竞争结合,夹心结合,样品浓度,样品浓度,光释放 (RLUs),光释放 (RLUs),Sorin,LIAISON,About LIAISON,Detection system: “Flash” chemiluminescence,Data reduction: Master Curve, Calibrators, Working Curve,Solid phase : Superparamagnetic microparticle
10、s (“magnetic particles”),LIAISON Solid phase,Superparamagnetic microparticles (“magnetic particles”),Are bound to bait molecules (Ag or Ab) through functional groups Allow bound/free separation step in liquid phase Note: they are not “magnetic” themselves, but respond to a magnet,LIAISON “Magnetic p
11、articles”,LIAISON Detection system,The Diagnostic Specialist,A chemiluminescent molecules achieves an excited state due to a chemical reaction. Energy gap is then released as “light”: “Flash” chemiluminescence: energy release within seconds “Glow” chemiluminescence: energy release within minutes On
12、Liaison, flash chemiluminescence is based on an isoluminol derivative (ABEI) bound to the tracer Reaction takes places with starter (trigger) reagents: “Starter 1”: sodium hydroxide (NaOH) 4% and catalysts “Starter 2”: hydrogen peroxide (H2O2) 0.12%,LIAISON chemiluminescence,LIAISON reaction scheme:
13、,LIAISON chemiluminescence,1. Presentation of reaction module to measure window,2. Injection of Starter 1 (200 L),3. Delay: 2.55 sec.,4. Injection of Starter 2 (200 L) light emission starts,5. Delay: 0.1 sec.,6. Measure (3 sec.) and data conversion to RLU,7. Suction of reaction mixture and move reac
14、tion module for next cavitys measure,Easy ABEI-labelling procedure: Reproducible Labelling process can be controlled A small synthetic molecule rather than a “big” enzime: small size allows more ABEI molecules per target molecule (e.g. antibody) more signal target molecule affinity not affected high
15、er stability expected Fast chemiluminescence reaction: Signal is achieved in 3 seconds Wide signal (“RLU”) dynamic range Wider dose/response curves More dose/response linearity,LIAISON chemiluminescence: main advantages,LIAISON technology: improvement in “dynamic range”,Improvement in signal performance of LIAISON vs. ELISA,Abbott Architect i2000SR,总览: 2003年重新设计上市 检测技术: 丫啶酯化学发光 最大速度200测试/小时 试剂位：25个，有冷藏,
