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1、文件编码: DK/CD-SOP-QC-004-03 第 19 页 共 19 页1 目的规范微生物限度检验操作，确保检验结果准确、可靠。2 依据中国药典2010版。3 范围本标准适用于微生物限度检验。4 责任中心化验室负责人：对本规程的实施负责。中心化验室检验人员：严格按照本规程执行检验操作。5 程序5.1 执行标准：中国药典2010版。5.2 抽样：照取样标准操作规程进行。6 细菌、霉菌及酵母菌计数计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。6.1 设备、仪器及用具6.1.1 设备微生物限度检测室室、净化工作台、生化培养箱（30-350C
2、）、生化培养箱（23-280C）、电热恒温水浴锅、烘箱、电冰箱、灭菌柜、紫外灯等。6.1.2 仪器及器皿显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、薄膜过滤器等。6.1.3 用具大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。6.2 试液6.2.1 消毒液 A0.1% 新洁尔灭溶液：供手消毒、擦拭操作台面用。 B75%乙醇溶液6.2.2 稀释液、试剂及配制 APH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.3g、蛋白胨1.0g，加纯化水1000
3、ml，微温溶解，滤清，分装，1210C灭菌15分钟。 B聚山梨酯80 C吐温80D单硬脂酸甘油酯6.3 培养基营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基6.4 操作方法6.4.1 试验前准备6.4.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、试管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀释剂等移至传递窗内。每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。6.4.1.2 开启微生物检测室紫外灯和空调净化系统，并使其工作不低于30min。6.4.1.3 操作人员进入一更，用洗手液或肥皂洗手，烘干。进入二更，用0.1% 新洁尔灭溶液洗手，穿戴洁净无菌服、口罩、手套。6.4.1.4 操作前先用乙醇
4、棉球擦手，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。6.4.2 供试液的制备供试液的制备若需用水浴加温时，温度不宜超过450C，时间不得超过30分钟。除另有规定外，常用的供试液制备方法如下：6.4.2.1 液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1:10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。6.4.2.2 固体、半固体或粘稠性供试品取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用适宜的方法，混匀，作为1:10的供试
5、液。必要时加入适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。6.4.2.3 乳膏剂取供试品5g（或5ml），加至含溶化的（温度不超过45）的吐温80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌成团后，慢慢加入45的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20供试液。6.4.2.4 栓剂取供试品10g，加适量稀释液，置45水浴保温10分钟，使溶，加入无菌聚山梨酯80 5-8ml，振摇使之乳化，再加稀释液（稀释液和聚山梨酯80的总量为100ml），摇匀，作为1:10的供试液。6.4.2.5 肠溶制剂取供试品
6、10g，加PH6.8无菌磷酸盐缓冲液至100ml，45水浴中，振摇，使溶解，作为1:10的供试液。6.4.3 供试液的稀释取1支1ml灭菌吸管吸取1:10均匀供试液1ml，加入装有9mlPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中混匀，即为1:100供试液。（此时操作一般为：左手执试管并将塞打开、倾斜，右手执10ml吸管吸量，注意：勿在乙醇灯焰峰正上方操作，以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭）以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1:1000、1:10000等适宜稀释级。每递增1稀释剂，必须另换一支吸管。稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部
7、刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，吸管移至第2级稀释管的内壁近液面处（勿接触液面）缓慢地放出全部供试液（吸管内应无黏附或残留液体）。6.4.4 检查法6.4.4.1 平皿法6.4.4.1.1 在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取每级稀释级供试液各1ml置每个灭菌平皿中，每一稀释级每种培养基至少注23个平皿（一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注平皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流至吸管尖端部。6.4.4.1.2 阴性对照 用1支1ml吸管吸取试验用稀释液（PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）各1ml，分别注入4个平皿中。其中两个
8、作细菌数阴性对照：另两个作霉菌、酵母菌数阴性对照。阴性对照不得有菌生长。6.4.4.1.3 倾注培养基 将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂，霉菌、酵母菌计数用玫瑰红钠琼脂培养基）熔化，置45。C水浴中，备用。将45。C左右的琼脂倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速转动平皿（勿使培养基溢出）使供试液与培养基混匀，放置，待凝。6.4.4.1.4 培养细菌计数平板倒置于30-35培养箱中培养3天。霉菌、酵母菌计数平板倒置于23-28培养箱中培养5天，必要时可延长至7天。逐日观察菌落生长情况，点计菌落数， 6.4.4.1.5 菌落计数将平板置观察台上用标记笔点计，以透射光衬以暗色
9、背景，仔细观察，计数。必要时借助于放大镜和显微镜观察。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红纳琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红纳琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红纳琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红纳琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细
10、菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。6.4.4.1.6 菌数报告规则细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数小于100cfu的平板计数，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10 c 供试品中所含的菌数。如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。6.4.4.2 薄膜过滤法6.4.4.2.1 采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45m，直径约为50mm。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前
11、应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。6.4.4.2.2 取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每1g或1ml所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml,过滤。用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜。冲
12、洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红那琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。滤膜贴于平板上是不得有空隙或气泡，否则影响微生物的生长。6.4.4.2.3 阴性对照 取试验用的稀释液1ml照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。6.4.4.2.4 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过100cfu。6.4.4.2.5 菌数报告规则 以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以1报告菌数（每张滤膜过来1g或1ml供试品），或1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。6.4.4.3 培养基稀释法
13、取低稀释级供试液（原液或1:10供试液或其他供试液）2份，每份各1ml，分别注入平皿中（每皿0.5ml、0.2ml或0.2ml），每1个平皿倾注培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。每份供试液所加注平板点计的菌落之和，即为每1ml菌落数，公的2组数据。以两份低稀释级供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。6.4.4.4 结果报告6.4.4.4.1 菌落数在100以内时，按实有数据报告。6.4.4.4.2 菌落数大于100时，取两位有效数字报告，第三位按数字修约规则处理。6.4.4.5 复试供试品细菌数、霉菌及酵母菌数其中一项一次检验不合格，应从同一批样品中随机重新取2倍包装量供试品，依
14、法作单项复试两份，以三次检验结果的均值报告。若3次结果的平均值超过该品种项下的规定，判供试品不符合规定：否则，判供试品符合规定。控制菌检查控制菌检查是用于检查某些特定微生物（控制菌或其他致病菌），按一次检出结果为准，不再复试。检查时，按已验证的方法进行供试品的控制菌检查。7 大肠埃希菌7.1 设备、仪器及用具7.1.1 设备微生物限度检测室室、净化工作台、生化培养箱（30-350C）、电热恒温水浴锅、烘箱、电冰箱、灭菌柜、紫外灯等。7.1.2 仪器及器皿显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、薄膜过滤器等。7.1.3 用具大、小橡皮乳头，
15、洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。7.2 试液指示液PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液、靛基质试液、革兰染色液、碘液、95%乙醇。7.3 培养基 胆盐乳糖培养基（BL）、4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸培养基（MUG）、曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）或麦康凯琼脂培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基等。7.4 操作方法7.4.1 增菌培养取胆盐乳糖培养基（BL）2瓶，每瓶各100ml，1瓶加入供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2)，1瓶加入10ml的稀释液作阴性对照。30-350C培养18-24h，必要时可延至48h。阴性对照应无菌生长。取上述培养物0.2ml，接种至5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，
