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1、附件厦门市专利奖申报书专利名称： 一种金线莲指纹图谱的建立方法 专 利 号： ZL 2012 1 0203783.4 申报人（盖章）： 福建金草生物集团股份有限公司 二一四年 8 月25 日厦门市知识产权局监制一、厦门市专利奖申报项目基本情况表专利名称一种金线莲指纹图谱 的建立方法技术领域中药材鉴定专 利 号ZL 2012 1 0203783.4授权公告日2014年05月21日申报人福建金草生物集团股份有限公司专利权人福建金草生物集团股份有限公司发明人/设计人胡珊梅、陈咏梅、吴波联 系 人许燕如手机15985819341通讯地址及邮编厦门市翔安区海翔大道海鸣路506-508号电话0592-35
2、01777实施状况实施单位许可种类许可金额合同履行情况福建金草生物集团股份有限公司向我国大陆地区外申请专利情况国家/地区申请时间法 律 状 态无二、专利质量评价材料评价“三性”和“文本质量”,说明参评专利质量的优秀程度1、新颖性和创造性：在金线莲药材的质量评价方面，最接近本发明专利的鉴定方法是“金线莲薄层色谱鉴定”、“RP-HPLC测定金线莲超声波-微波协同萃取物化学活性成分含量”两项鉴定技术。（1）“金线莲薄层色谱鉴定”具体实施方案为将金线莲干燥后粉碎，加入三氯甲烷，水浴回流，冷却，过滤，弃去三氯甲烷液，残渣挥干，加甲醇溶解，制成供试品溶液。并以同样方法制成对照药材溶液。将供试品溶液点样于薄
3、层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得薄层色谱图与对照药材溶液按同法所得的色谱图作对比，用薄层扫描仪进行扫描，结果测定。（2）“RP-HPLC测定金线莲超声波-微波协同萃取物化学活性活性成分含量”具体实施方案为应用超声-微波协同提取珍稀金线莲药材中的黄酮类成分,正交实验对提取工艺进行了优化;RP-HPLC测定其含量,色谱柱为Agilent C18柱(4.6250 mm,5m),甲醇-水-磷酸(52480.04)为流动相,流速1.0 ml/min,检测波长368 nm，3个黄酮类成分槲皮素、山萘酚、异鼠李素在该色谱条件下分离,测定金线莲药材,槲皮素、山萘酚和异鼠李素含量。“
4、金线莲薄层色谱鉴定”、 “RP-HPLC测定金线莲超声波-微波协同萃取物活性成分含量”未对本参评专利的新颖性和创造性构成实质性影响，具体说明如下：（1）薄层色谱鉴定别显色反应只能定性分析金线莲中4个强心苷类化合物，不能定量检测提取液中的有效成分，存在专属性不强，灵敏度不高等缺陷，无法很好的准确鉴别和评价金线莲药材质量。（2）本发明“供试品溶液的制备”步骤相比“RP-HPLC测定金线莲超声波-微波协同萃取物活性成分含量”简单，仅采用超声提取，简化了程序，减少了损失。同时，本发明用甲醇来提取的化学信息量最丰富，提取的成分含量比较高（通过峰面积来比较），所以参评发明采用效果更好的甲醇来做溶剂和作为梯
5、度洗脱液，并且参评专利发明人经过大量的波长试验，试过无数波长，最后选定化学信息量最多，色谱峰比较漂亮的313-318nm作为本发明的波长范围，而并非最大峰的波长就可以，比如在254nm下并没有峰出现。（3）本参评发明专利克服现有的技术缺陷，首创利用高效液相色谱方法建立金线莲液相指纹图谱，提出一种内参照峰的指纹图谱鉴别方法，解决了目前缺乏金线莲有关成分对照品的难题，得到的各特征峰相对保留时间和相对峰面积更稳定，能够较全面体现整体化学信息，方法精密度更好，实现定性、定量检测金线莲中的甲醇提取液中的强心苷类、化合物等成分，提高了金线莲质量控制水平。2、实用性：本参评专利主要从以下几个方面评价其实用性
6、：（1）可操作性强。本参评专利无特定要求的自然环境，其操作步骤包括（1）供试品溶液的制备；（2）色谱条件确认、梯度脱洗；（3）精密吸收供试品溶液，将其注入高效液相色谱仪，依照高效液相色谱法测定。操作方法简便，对操作人员的专业要求不高。（2）再现性好。应用参评专利进行金线莲质量检测，主要技术难点是检测波长及梯度脱洗程序的确定，本专利发明人经过大量实验，反复筛选测定，已精确确认相关检测参数。因此，检测人员只需严格按照确定好的参数，需依照本参评专利公开的技术方案进行操作，不存在依赖任何随机的因素，再现性好，可重复实施。（3）应用范围广。专利权人福建金草生物集团股份有限公司是全国最大的金线莲供应商，下
7、设四家子公司，在翔安、武平、明溪、永春建有标准化金线莲种植基地，年产金线莲种苗8亿株。目前，公司已经成熟应用本参评专利全面检测从子公司及农户收购来的金线莲种苗，并指导四家子公司应用本专利开展自检。实现提高金线莲质量控制水平。三、技术先进性评价材料（一）技术原创性及重要性1、技术原创性本参评专利“一种金线莲指纹图谱的建立方法”首次引用“高效液相色谱法”鉴定金线莲品质，属国内首创技术，是基础型发明专利。随着农业技术发展，金线莲人工培育的障碍解除，2010年后，国内已初步形成金线莲规模化种植。在金线莲的质量评价方面，目前国内外发表的文献中，一般采用显微鉴定、薄层色谱鉴定或单一成分含量测定等理化检查，
8、不能准确鉴别福建、台湾金线莲和伪品的区别，评价金线莲药材质量的优劣。本参评专利发明人克服现有的技术缺陷，运用高效液相色谱方法建立金线莲指纹图谱，运用指纹图谱的内参照峰作为参照，得到的各特征峰的相对保留时间和相对峰面积更稳定，精密度高，为金线莲的质量检测和质量控制提供标准。具体步骤如下：（1）供试品溶液的制备：精密秤取供试品细粉0.15g置于具塞三角烧瓶中，精密加入甲醇10100ml，密塞，精密称定，超声处理3555分钟后，放冷至温室，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心715分钟后取上清液，将该上清液经滤膜过滤后，得到供试品溶液。（2）色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；洗脱方式：以0.
9、4%磷酸和甲醇组成的梯度洗脱液为流动相，进行梯度洗脱；柱温：2530；紫外检测：检测波长为313318nm；流速：0.81.2ml/min;梯度脱洗的程序按以下体积浓度配置进行:0分钟时，流动相为25%的甲醇和75%的0.4%磷酸溶液；30分钟时，流动相为50%的甲醇和50%的0.4%磷酸溶液；45分钟时，流动相为75%的甲醇和25%的0.4%磷酸溶液；55分钟时，流动相为75%的甲醇和25%的0.4%磷酸溶液；60分钟时，流动相为25%的甲醇和75%的0.4%磷酸溶液；65分钟时，流动相为25%的甲醇和75%的0.4%磷酸溶液。（3）测定：精密吸收供试品溶液5L,将其注入高效液相摄谱仪，依照
10、高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。图2-1：福建金线莲（尖叶）组培品的HPLC指纹图谱图2-2：台湾金线莲（一等）组培品的HPLC指纹图谱图2-3：福建金线莲（大叶）野生品的HPLC指纹图谱图2-4：市售金线莲伪品的HPLC指纹图谱2、技术重要性福建省是全国金线莲产量最大的省份，金线莲产业具有得天独厚的优势，研究金线莲的人工培养增殖技术，对于促进金线莲的可持续利用，发展现代农业，振兴地方特色产业尤为必要。（1）实现金线莲品质可控制。在本参评技术未成熟前，公司主要采用显微鉴定和薄层色谱鉴定，无法准确鉴别金线莲质量，金线莲质量安全方面存在一定的隐患，给公司经营销售带来一定的阻力。目前，本参评专利已
11、成熟应用于包括福建金线莲、台湾金线莲在内的各品种金线莲检测，保证了公司金线莲产品的质量。（2）优化良种选择，促进系统开发利用。运用高效液相色谱建立金线莲的指纹图谱，提高金线莲质量控制水平，促进优良金线莲品种的选择；运用内参照峰的指纹图谱作为参照，得到的各特征峰的相对保留时间和相对峰面积更稳定，方法精密度更好，有利于识别判定不同生长时期金线莲的有效成分及系统开发利用，优化金线莲种植周期，大幅提高原草利用率和附加值。同时，由于本项技术成熟应用，在一定程度上帮助了公司取得药品生产许可证及GMP证书。通过本技术的应用，将常规的单一指标成分或活性成分为质量控制的指标提升到一个新的阶段，采用高效液相色谱法
12、获得指纹特征，通过指纹图谱得到的量化参数，更有效鉴别金线莲真伪及质量。（二）技术优势本参评专利技术属国内首创，其具体技术优势主要体现在以下几个方面：（1）检测成本低。本检测方法所需仪器主要有高效液相色谱仪、超声波清洗机，设备费用相对较低；此外还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收。检测成本相对较低。（2）高速，高效，高灵敏度。分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个金线莲样品在1530分钟，一般小于1小时。分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比精馏塔和气相色谱薄层色谱的分离效能高出许多倍。高灵敏度，紫外检测器最低可达0.01ng，进样量在L数量级。（
13、3）准确评价金线莲质量。精密秤取供试品细粉0.2g置于具塞三角烧瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，精密称定，超声处理45分钟后，放冷至温室，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心10分钟后取上清液，将该上清液经0.25m滤膜过滤后，得到供试品溶液。同时，柱温30；检测波长为316nm；流速：1.0ml/min。通过本参评专利公开的技术方案，解决目前行业内缺乏金线莲有关成分对照品的难题，建立有效成分标准，为种苗和成品的质量控制提供参考，实现定性定量评价金线莲质量。（三）技术通用性本参评专利已应用于福建省濒危药用植物-金线莲的检测，其应用范围包括福建金线莲、台湾金线莲等在内的各个品种；各种植阶段的种苗、
14、鲜品等不同生长期的。四、运用及保护措施和成效评价材料（一）（一）专利运用： 1、运用措施（1）建立研发、生产与销量良性循环体系。公司通过加大研发经费的投入、聘用高级科研人才、与高校开展产学研合作等采取一序列措施，提升企业研发实力，推动专利产出与成果转化，实现销售收入的快速增长，而销售的增长又为研发投入提供资金保障，形成良性循环。同时，公司规定每年研发投入不得低于销售收入的7%。（2）建立专利项目立项管理制度及经费核算制度。为确保专利项目的有效实施，确实提高生产技术水平，提升产品竞争优势，公司建立专利项目立项管理制度及经费核算制度。专利项目的立项需经可行性分析、试验方法、技术路线、人员梯队和实验条件等方面的论证，并建立经费核算体系，在有效控制成本基础上，最大限度保障专利有效实施并带来经济效益。2、应用成效（1）专利产品实现销售收入稳定增长。公司现拥有发明专利3项，实用新型专利11项。公司将专利技术实现产业化，生产出多种类、多系列专利产品，如炖煮系列、泡饮系列等，平均每年都出1-3款专利新品系列，专利产品销量占总销售量的80%以上，2013年度公司实现销售收入1.35亿元，同比增长5.47%。由于专利技术的有效转化，产品优化，实现公司“草之典”连锁经营品牌在全国拥有超过200家加盟店，形成“依托福建，辐射全国”的销售格局，提升了公司的核心竞争力。（2）专利运用促企业发展。公司通过
