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1、 一 AFLP 分子标记实验扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism(AFLP 是在随机扩增多 态性 (RAPD 和限制性片段长度多态性 (RFLP 技术上发展起来的 DNA 多态性检测技术, 具有 RFLP 技术高重复性和 RAPD 技术简便快捷的特点, 不需象 RFLP 分析一样必须制备探针, 且与 RAPD 标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征,同时弥补了 RAPD 技术重复性差的缺陷。 同其他以 PCR 为基础的标记技术相比, AFLP 技术能同时检测到 大量的位点和多态性标记。 此技术已经成功地用于遗传多样性
2、研究, 种质资源鉴定方面的研 究,构建遗传图谱等。其基本原理是:以 PCR(聚合酶链式反应 为基础, 结合了 RFLP 、 RAPD 的分子标记技术。 把 DNA 进行限制性内切酶酶切,然后选择特定的片段进行 PCR 扩增 (在所有的限制性片段两 端加上带有特定序列的 “ 接头 ” , 用与接头互补的但 3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行 特异 PCR 扩增, 只有那些与 3-端严格配对的片段才能得到扩增 , 再在有高分辨力的测序胶上 分开这些扩增产物,用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。一、 实验材料采用青稞叶片提取总 DNA 。二、 实验设备1. 美国贝克曼库尔特 CEQ8000
3、毛细管电泳系统,2. 美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机,3. 美国 MJ 公司 PCR 仪,4. 安玛西亚电泳仪等。三、 实验试剂1. 试剂:请使用高质量产品,推荐日本东洋坊 TOYOBO 公司的相关产品。DNA 提取试剂盒;EcoRI 酶,MseI 酶,T4连接酶试剂盒;Taq 酶,dNTP, PCR reaction buffer; 琼脂糖电泳试剂:琼脂糖,无毒 GeneFinder 核酸染料替代传统 EB 染料; 超纯水(18.2M cm2.其他实验需要物品微量移液枪(一套及相应尺寸 Tip 头,PCR 管,冰浴等。四、 实验流程1、 总 DNA 提取使用 DNA 提取试剂盒提取植物基因组
4、 DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑 胶检测。一般来说, 100ng 的基因组 DNA 作为反应模板是足够的。2、 EcoR1酶消化 (20ul 体系 /样品EcoR1 1ul10Buffer 2ul 37 65 30min终止反应 sample(总 DNA 5ulddH 2O 12ul3、 Mse1酶消化 (20ul 体系 /样品Mse1 2ul (1U/ul10Buffer 2ulsample(EcoR1酶切产物 80 30min终止反应 ddH 2O 1ul4、 T4 DNA Ligase(20ul 体系 /样品T4 DNA Ligase 2ul(1U/ul10Buffer 2u
5、lsample(双酶切产物 10ulMse1 Adaptor 1ul 2265 10min终止反应 EcoR1 Adaptor 1ulddH 2O 4ul5、 预扩增 (20ul 体系 /样品sample 4ulPrimer(Mse1/EcoR1 1ul AFLP Core Mix 15ul* AFLP Core Mix 配方:ddH 2O 13.8ulMgCl 2 1.6uldNTPs(2.5mM 1.6ulTaq 酶 (1U/ul 1ul10Buffer 2ul预扩增程序:94 2min945672 2min60 30min6、选择性扩增 (20ul 体系 /样品sample 4ul(预扩
6、增产物稀释 20倍 Primer(Mse1-XXX/EcoR1-XXX 1ulAFLP Core Mix 15ul选择性扩增程序:94 2min94 20s66 30s 每循环降 1,共 10个循环 72 2min94 20s56 30s 20个循环72 2min60 30min7、产物电泳检测上样液:Loading Buffer 20ulSize standard-600 0.2ul Sample 3ul(稀释 10倍 四、实验结果与分析本实验使用贝克曼库尔特 (BeckmanCoulter 公司 CEQ8000遗传分析系统, 运用先 进的荧光标记技术和毛细管电泳分离技术进行实验, 扩增产物
7、在高分辨率毛细管中电泳 分离,采用激光激发荧光采集数据,灵敏度极高,电泳结果通过软件自动统计分析并转 换成“ 0、 1”矩阵,便于对结果进一步深入分析研究,整个电泳、数据采集和数据分析 过程由软件来控制完成,最大程度避免了人工操作造成的误差,提高了数据的可靠性。 产物电泳数据采集在 CEQ8000遗传分析系统上进行(图 1 ,得到的数据(图 2用第三方软件再进一步统计分析。 图 1 AFLP分子指纹图谱 图 2 AFLP“ 0、 1”矩阵图 AFLP 操作流程图:酶切Mse1酶切 优化 数据分析附录 1:常用的 8对 AFLP 选择性扩增引物:E-AGG: 5-GACTGCGTACCAATTC
8、AGG -3E-ACG: 5-GACTGCGTACCAATTCACG -3E-AAC: 5-GACTGCGTACCAATTCAAC -3E-ACA: 5-GACTGCGTACCAATTCACA -3E-AGC: 5-GACTGCGTACCAATTCAGC -3E-ACT: 5-GACTGCGTACCAATTCACT -3E-AAG: 5-GACTGCGTACCAATTCAAG -3 Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站: 地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706E-ACC: 5-GACTGCGTACCAATTCACC -3
9、M-CAA: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAA -3 M-CAC: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAC -3 M-CAG: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAG -3 M-CTA: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTA -3 M-CAT: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CAT -3 M-CTC: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTC -3 M-CTG: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTG -3 M-CTT: 5-GAT GAG TCC TGA GTA A CTT
10、 -3附录 2:AFLP 传统垂直板电泳 (银染法检测 介绍:原理与方法同前,区别:1. 选择性扩增引物不带荧光标记; 2. 电泳方法不同,采用测序 胶垂直板电泳; 3. 电泳结果采用银染法,比较直观,但条带的统计与分析全人工化,工作量 大,银染法灵敏度比荧光标记法要低。示例:下图为玉米(maizeDNA的 AFLP 图谱。 Panel A: AFLP fingerprints of control maize DNA using EcoR1 primer E-AGG with eight Mse1 primers: M-CAA (1, M-CAC (2, M-CAG (3, M-CAT (4
11、, M-CTA (5, M-CTC (6, M-CTG (7, and M-CTT (8.Panel B: AFLP fingerprints of control maize DNA using Mse1 primer M-CAG with eight EcoR1 primers: E-AAC (a, E-AAG (b, E-ACA (c, E-ACT (d, E-ACC (e, E-ACG (f, E-AGC (g, and E-AGG (h.Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站:地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-170
12、6Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站:地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706 二 ISSR分子标记的实验原理及操作流程ISSR(inter-simple sequence repeat标记是一种类似 RAPD,但利用包含重复序列 并在 3 或 5 锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统,即用 SSR 引物来扩增重 复序列之间的区域。其原理具体是,ISSR 标记根据生物广泛存在 SSR 的特点,利用在生物 基因组常出现的 SSR 本身设计引物,无需预先克隆和测序。用于扩增的引物一般为 16-18个碱基序列, 由
13、1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成, 从而保证了引物 与基因组 DNA 中 SSR 的 5 或 3 末端结合,导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的 基因组节段进行 PCR 扩增。一、实验材料不同来源的 DNA(30-50ng/ul。二、实验设备PCR 仪, PCR 管或硅化的 0.5ml eppendorf管,电泳装置,凝胶成像仪。三、试剂1、 ISSR 引物:购买成品或根据加拿大 British Columbia大学设计的 ISSR 引物序列(见 附录自己合成。 2、 Taq 酶3、 10xPCR 缓冲液4、 MgCl 2:25mmol/L。 5、 dNTP :2.5
14、mmol/L。四、操作步骤:1. 在 25ul 反应体系中,加入 模板 DNA 1ul (30-50ng ISSR 引物 1ul (约 5pmol 10xPCR Buffer 2.5ul MgCl 2 2uldNTP 2ulTaq 酶 1单位(U 加 ddH2O 至 25ul混匀稍离心 , 加一滴(约 20 ul矿物油。2. 在 PCR 仪中预变性 94 2分钟 , 然后循环 : 94 1分钟, 45 -68 40秒, 72 1-2分钟,共 40轮循环。3. 循环结束后 , 72 10分钟, 4保存。4. 取 PCR 产物 15ul 加 3ul 上样缓冲液 (6x于 1.6% 或 1.8% 琼
15、脂糖胶上电泳 , 稳压 50-100 V(电压低带型整齐, 分辨率高 。5. 电泳结束,溴化乙锭染色 20分钟。6. 用凝胶成像仪观察、拍照。操作流程简图: 地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706 Tel: +86 532 80998002 Fax: +86 532 80998005 网站: 地址:山东省崂山区山东头路 58号盛和大厦 2-1706注:样品可以采用新鲜样品,硅胶干燥样品,标本等 DNA提取可采用CTAB或SDS法DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法附录 UBC Primer Set #9 (Microsatellite引物名称序列引物名称 序列801 ATA TAT ATA TAT ATA TT851 GTG TGT GTG TGT GTG TYG 802 ATA TAT ATA TAT ATA T
