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1、基因定点突变一,定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基.二,定点突变的原理通过设计引物,并利用PCR将模板扩增出来,然后去掉模板,剩下来的就是我们的PCR产物,在PCR产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定就行了.三,引物设计原则引物设计的一般原则不再重复.突变引物设计的特殊原则:(1)通常引物长度为2545 bp,我们建议引物长度为3035 bp.一般都是以要突变的碱基为中心,加上两边的一段序列,两边长度至少为11-12 bp.若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失败,因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上,而这种突变PCR要求两边都能与引
2、物搭上,所以两边最好各设至少12个bp,并且合成多一条反向互补的引物. (2)如果设定的引物长度为30 bp,接下来需要计算引物的Tm值,看是否达到78(GC含量应大于40%). (3)如果Tm值低于78,则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78(GC含量应大于40%). (4)设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置. (5)最好使用经过纯化的引物.Tm值计算公式:Tm=0.41(% of GC)675/L+81.5 注:L:引物碱基数;% of GC:引物GC含量.四,引物设计实例以GCGACG为例:5-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3(1)首先
3、设计30 bp长的上下游引物,并将A (T)设计在引物的中央位置.Primer #1: 5-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3 Primer #2: 5-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3(2)引物GC含量为40%,L为30,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm=75.5(Tm=0.4140-675/30+81.5).通过计算可以看出其Tm低于78,这样的引物是不合适的,所以必须调整引物长度.(3)重新调整引物长度.Primer #1: 5-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3 Primer
4、 #2: 5-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3在引物两端加5mer(斜体下划线处),这样引物的GC含量为45.7%,L值为35,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm为80.952(Tm=0.4147.5-675/35+81.5),这样的引物就可以用于突变实验了.五,突变所用聚合酶及Buffer引物和质粒都准备好后,当然就是做PCR喽,不过对于PCR的酶和buffer,不能用平时的,我们做PCR把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个K,所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer,另外,要用保真性能较好的PFU酶来扩增,防止引进新的突变.除
5、了使用基因定点突变试剂盒,如Stratagene和塞百盛的试剂盒,但价格昂贵.可以使用高保真的聚合酶,如博大泰克的金牌快速taq酶,Takara的PrimeSTARTM HS DNA polymerase.六,如何去掉PCR产物最简单的方法就是用DpnI酶,DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切,我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒,从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来(除非你用的是甲基化缺陷型的菌株),而PCR产物都是没有甲基化的,所以DpnI酶能够特异性地切割模板(质粒)而不会影响PCR产物,从而去掉模板留下PCR产物,所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株.DpnI处理的时间最
6、好长一点,最少一个小时吧,最好能有两三个小时,因为如果模板处理得不干净,哪怕只有那么一点点,模板直接在平板上长出来,就会导致实验失败.七,如何拿到质粒直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了,然后再筛选出阳性克隆,并提出质粒,拿去测序,验证突变结果.八,图示九,定点突变操作步骤A 诱导突变基因(PCR反应)以待突变的质粒为模板,用设计的引物及Muta-direct 酶进行PCR扩增反应,诱导目的基因突变.1. 设计点突变引物. 注参考引物设计指导2. 准备模板质粒DN A注用dam+型菌株(例如DH5菌株)作为宿主菌.在end+型菌株中常有克隆数低的现象,但是对突变效率没有影响.提取
7、质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒.3. 选项对照反应体系(50l反应体系)10Reaction Buffer5lpUC18 control plasmid(10ng/l,total 20ng)2lControl primer mix(20pmol/l)2ldNTP mixture(each 2.5mM)2ldH2O 38lMuta-direct Enzyme1l4. 样品反应体系(50l反应体系)10Reaction Buffer5lSample plasmid(10ng/l,total 20ng)2lSample primer (F)(10pmol/l)1lSample pr
8、imer (R)(10pmol/l)1ldNTP mixture(each 2.5mM)2ldH2O38lMuta-direct Enzyme1l5. PCR反应条件注按如下参数设置PCR扩增条件.CyclesTemperature Reaction Time1cycle95 30sec15cycle9530sec551min721min per plasmid Kb6. PCR扩增反应完成后冰育5分钟,然后置于室温(避免反复冻融).注 按下列提供的PCR条件进行扩增,控制PCR循环数.注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象.MutationCycles 12Nucleotide15
9、cycles3Nucleotides18cyclesB 突变质粒选择PCR反应结束后使用Mutazyme 酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA.1. 准备PCR反应产物2. 加入1l(10U/l)Mutazyme 酶37温育1小时.注当质粒DNA用量过多时Mutazyme 酶可能发生与样品反应不完全的现象.因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作.如果突变率低,可以适当延长反应时间或增加Mutazyme 酶用量.C转化反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口,当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株,例如DH5.1. 将10l样品加到50l感受态细胞里,然后放置在冰上30分钟. 2. 接下来可以参照一般的转化步骤进行.序列分析通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变. 为了证实这一结果,我们建议对白色单菌落进行测序分析.
