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1、温州医学院 硕士学位论文 百草枯急性中毒大鼠肺组织炎症因子的变化及二巯丙磺钠的干 预 姓名：贺晓艳 申请学位级别：硕士 专业：急诊医学 指导教师：卢中秋 20090501 温州医学院硕士学位论文 百草枯急性中毒大鼠肺组织炎症因子的变化 及二巯丙磺钠的干预 中文摘要 目的：探讨百草枯急性中毒大鼠肺组织T N F Q 、I L 1 0 的基因表达，肺组织H M G B 的基因及蛋白水平的表达及二巯丙磺钠的干预。 方法： 1 清洁级雄性S D 大鼠1 0 0 只，随机分成4 组：( 1 ) 正常对照组( N C 组) ： 1 0 只；( 2 ) N a D M P S 对照组：1 0 只，以2 0
2、0 m g k gN a D M P S 腹腔注射；( 3 ) P Q 染毒组( P Q 组) ：4 0 只，予1 的P Q 剂量2 0 m g k g 一次性左腹腔注射染 毒；( 4 ) 二巯丙磺钠保护组( N a D M P S 组) ，4 0 只，右腹腔注射 2 0 0 m g k g N a - D M P S 后1 5 m i n ，予1 的P Q ，2 0 m g k g 一次性左腹腔注射染毒。 N C 组及N a - D M P S 对照组于染毒后l d ，P Q 组及N a - D M P S 组于染毒后6 h ， 1 d ，3 d ，7 d 各取1 0 只活杀，取部分肺组织行
3、病理观察及电镜检查，余肺组织 于液氮中保存待用。 2 观察P Q 组和N a - D M P S 组大鼠在染毒后行为学改变，肺组织病理及电镜改变。 3 R T - P C R 法检测各组大鼠肺组织T N F a 、I L 1 0 、H M G B 1 基因的相对表达量， W e s t e r nb l o t 法测定肺组织H M G B 1 蛋白的表达。 结果： 1 P Q 组大鼠于染毒后l h H P 出现少动、萎靡和厌食，症状进行性加重，5 h 后出现 呼吸急促、四肢无力等表现，1 “ 3 d 为最明显，3 d 后大鼠开始进食，精神状态、 呼吸困难及四肢无力等表现好转，7 d 时中毒症状
4、明显减轻，进食正常，无明 显呼吸困难等。N a D M P S 组大鼠精神状态、呼吸困难等症状均明显轻于P Q 组，7 d 时大鼠基本恢复正常。 2 P Q 组大鼠6 h 、1 d 及3 d 肺泡及肺血管充血水肿明显，肺泡腔见红细胞渗出，肺 间质大量炎症细胞浸润，7 d 时肺炎性细胞、充血等轻。N a - D M P S 组亦出现了 肺炎性细胞、充血等上述表现，但程度明显减轻。电镜下P Q 组大鼠肺组织上 皮细胞核固缩，板层小体空泡化，间质炎性细胞浸润，N a D M P S 组上述改变 明显减轻。 3 P Q 组及N a - D M P S 组大鼠染毒后肺组织T N F i f , m R
5、N A 、I L 1 0m R N A 及 H M G B 1m R N A 表达量升高，T N F am R N A 以染毒后6 h 最高，I L 1 0m R N A 及H M G B 1m R N A 以染毒后1 d 最高，后逐渐降低。与同时间点P Q 组相比， N a - D M P S 组n 盯am R N A 明显下降，以染毒后6 h 及l d 明显( 氏O 0 5 ) ， 2 温州医学院硕士学位论文 I L 1 0m R N A 明显升高，以染毒后6 h 、1 d 及3 d 明显( 尸 00 5 ) ：( 3 ) P Q 组及N a - D M P S 组大 鼠肺组织T N F
6、nm R N A 6 h 升高最明显，l d 开始下降6 h 及l 较N C 组升高有显 著性差异( P 4 0 m g k g ( 对于成人，这个量相当于 1 5 m l2 0 百草枯浓缩液) 时，胃肠道、肺、肾、肝严重受损，很快发生多器官功能衰竭， 在1 7 d 内病死率达1 0 0 嘣化1 。 百草枯对身体各个脏器都有毒性，其中毒所致损害的机制非常复杂，至今未 能明确。既往的研究认为百草枯进入体内后经由N A D P H 辅助的单电子还原为自 由基，然后与氧反应形成超氧阴离子，后者能导致产生更多的活性氧，如：过氧 化氢、羟自由基，间接使体内巯基化合物、S O D 含量减少，影响机体的抗氧
7、化作 用，诱导脂质过氧化反应，肺细支气管的C l a r a 细胞和肺泡上皮细胞主动转运P Q 在肺内聚集，直接损害细胞的主要成分，其氧化损伤继发信号转导通路的改变， 细胞内和线粒体钙稳态失衡，还可直接损伤D N A 并诱导细胞凋亡，异常激活肺 部免疫细胞，促使蛋白质交联、失活，因而各脏器损伤中以肺损伤最严重 1 3 , 1 4 , 1 5 , 1 6 。随着近年来对百草枯中毒分子生物学机制研究的深入，人们发现百草 枯中毒后除了百草枯本身理化作用外，还有大量的炎性因子和细胞因子参与了组 织器官的损害和最终的纤维化。因而百草枯中毒后的炎症反应受到了越来越多的 重视，而抑制中毒后的炎症反应成为改善
8、百草枯中毒预后的个新方向。 研究表明，过度炎症反应是导致百草枯急性中毒肺损伤主要机制之一，过度 炎症反应可造成肺泡上皮细胞等损伤，增加肺血管通透性，加重水肿，导致细胞 外基质沉着，在百草枯急性中毒急性呼吸窘迫综合征( 川 m S ) 及肺间质纤维化 温州医学院硕士学位论文 的进展中起着重要作用，也是百草枯急性中毒后死亡的主要原因IJ 7 1 0 口服百草 枯中毒后除引起消化道糜烂、出血外，还可损害多个重要脏器，其中以肺损伤较 明显，可导致肺泡炎、急性肺水肿、进行性肺纤维化等，肺间质纤维化是百草枯 中毒晚期主要致死原因【l 引。而在过去关于百草枯中毒弥漫性肺损伤的病理变化 过程的研究中已经发现，
9、在中毒后1 7 d 为弥漫性炎症反应阶段，肺毛细血管和 小静脉内皮细胞、肺泡I 型和I I 型上皮细胞受损，表现为肺水肿、出血、炎症细 胞浸润【1 9 1 。已证实百草枯肺损伤所致的炎性反应特征表现为肺内皮细胞和上皮 细胞受损，血管通透性增加，脂质氧化物和多形核白细胞浸润，并随着服毒量增 大，多形核浸润加重I _ 7 1 。除百草枯毒物本身化学特点引起氧化应激反应，百草枯 中毒早期特征为炎性细胞在肺泡表面聚集，并释放氧自由基，在百草枯急性肺损 伤的发生有重要作用。M a s a f u m i 2 0 】等研究显示非致死量百草枯中毒大鼠肺组织 内I L 11 3m R N A 升高，在中毒后1
10、 6 “ 2 4 h 出现高峰。G r e g o r y 2 l J 等在给大鼠腹腔注 射P Q 2 5 m g k g 后，发现肺组织和支气管肺泡灌洗液中T N F Q 、干扰素吖( I F N - y ) 、 单核细胞炎症因子( M I P 2 ) 均较对照组明显升高，这些在染毒后l - - - - 2 d 内最显 著，M I P 2 升高水平与中性粒细胞浸润程度相符，肺内升高的炎性细胞( 尤其是 中性粒细胞、单核巨噬细胞) 和细胞种类表明百草枯在早期引起肺组织炎性反应， 毒性氧自由基、多种细胞因子和趋化因子等相互作用使其在肺内浸润、聚集、活 化，并进一步释放蛋白水解酶和氧自由基等引起肺
11、组织损伤。最近一些动物实验 还发现百草枯中毒不仅仅有肺炎性损伤，而是涉及全身各个脏器、系统的一个全 身炎症反应过程1 2 2 。 本实验我们通过构建百草枯急性中毒肺损伤大鼠模型，观察百草枯急性中毒 大鼠肺组织形态学变化，肺组织T N F am R N A 、I L 1 0 m R N A 及H M G B 1 m R N A 动 态表达，肺组织H M G B 1 蛋白表达的动态改变，以及二巯丙磺钠干预作用，探讨 急性百草枯中毒后肺组织早晚期炎症因子的变化特点，并对其作用机制进行初步 探讨。 T N F a 是由肺泡巨噬细胞分泌的一种多肽，能诱导白细胞迁移，粒细胞脱颗 粒和毛细血管渗漏，并诱导内
12、皮细胞和巨噬细胞释放I L 1 ，I L 1 随后又刺激产生 其他细胞因子，并增强组织细胞对T N F a 的敏感性，还能刺激其他细胞因子( 如 I L 1 B 、I L 6 等) 产生释放，刺激释放活性氧和多种酶，促进粒细胞在肺毛细血 管的聚集和激活，从而介导肺组织的损伤，与肺纤维化和间质性炎症有关， T N F a 作为早期炎症介质的代表反应了机体内早期炎症水平。而机体炎症反应启 动的同时抗炎反应亦启动，几1 0 是一种抗炎细胞因子的代表，能明显抑制单核 巨噬细胞的致炎作用，主要表现为抑制n 吓a 和I L 1 的合成和释放，可减轻炎症 反应，减少胶原的产生，有助于控制炎症，维持机体的稳态
13、，是损伤的一种代偿 温州医学院硕士学位论文 反应。有研究认为【2 3 1 T N F G t 、I L 1 0 水平可作为百草枯中毒后多器官功能障碍患 者多器官功能损害程度评估与预后判断的临床指标之一。 本实验中，正常大鼠肺组织T N F am R N A 、I L 1 0m R N A 的表达量均较少， 而百草枯中毒后大鼠肺组织T N F G tm R N A 表达量增加，染毒后6 h 即达高峰，之后 逐渐下降，在染毒后仍7 d 高于正常表达水平。百草枯中毒后大鼠肺组织I L 1 0 m R N A 表达量亦进一步增加，在染毒后6 h 开始上升，l d 达高峰，之后逐渐下降， 在染毒后仍7
14、d 高于正常表达水平。G r e g o r y 2 1 等在给大鼠腹腔注射P Q 2 5 m g k g ) ：舌， 发现肺组织和支气管肺泡灌洗液中T N F C t 较对照组明显升高，且在染毒后l “ - 2 d 内最显著，国内彭晓东【2 3 】等报道急性百草枯中毒后多器官功能障碍综合征患者 血清T N F a 、I L 1 0 及T N F a I L 1 0 在2 4 h 内较正常水平明显升高，以上均提示在百 草枯急性中毒后短期内炎性反应即启动，炎症因子的表达增加。本实验结果肺组 织T N F a 、I L 1 0 改变趋势与上述报道基本一致，I L 1 0 m R N A 表达高峰期
15、迟于 T N F am R N A 表达的高峰期，促炎细胞因子与抗炎细胞因子的表达处于失衡状 态，在染毒后3 d 内促炎反应占主导地位，此与大鼠染毒后3 d 内急性肺损伤、急性 肺组织炎密切相关。 H M G B 1 是于3 0 年前从细胞核中提纯得到的一种蛋白质，因其在电泳凝胶上 的迁移率高，故被命名为高迁移率族( h i g h m o b i l i t yg r o u p ，H M G ) 蛋白。H M G 蛋白是一类富含电荷的非组蛋白染色质核蛋白，分子量较低( 3 0 k D ) 。H M G 可分为3 个家族：H M G 1 2 家族、H M G 1 4 1 7 家族和H M G
16、 I ( 家族，其中以 H M G 1 2 家族种类最多，含量最丰富，平均为5 “ - - - - 1 0 个核小体，即含有一个H M G 1 2 分子。H M G 1 2 具有很高保守性，小鼠和大鼠的H M G 1 氨基酸序列完全相同， 而啮齿类与人类之间其氨基酸同源性高达9 9 。H M G 1 在结构上可分为三个区 域：带负电荷的C 2 末端区( 天门冬氨酸和谷氨酸) 、带正电荷的N 2 末端的A 盒 和B 盒【2 4 】，后两者为同源性的D N A 结合序列，B 盒区含促炎性细胞因子功能的 分子，而A 盒具有拮抗性的抗炎作用，因A 和B 盒为H M G 1 的主要功能区，故 瑚订G 1 又称为H M G B 1 。 W a n g 等【2 5 】首次提出了H M G B 1 是内毒素致死效应的晚期介质的概念，逐渐 被认为是一种迟发型炎性介质，与
