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1、高压液相色谱 HPLC 培训教程(一)I概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在 1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位
2、差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于 60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。二、H
3、PLC 的特点和优点HPLC 有以下特点：高压-压力可达 150300Kg/cm2。色谱柱每米降压为 75 Kg/cm2 以上。高速-流速为 0.110.0 ml/min。高效-可达 5000 塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达 100 种。高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达 0.01ng。同时消耗样品少。HPLC 与经典液相色谱相比有以下优点：速度快-通常分析一个样品在 1530 min，有些样品甚至在 5 min 内即可完成。分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高-紫外检测器可达 0.01ng，荧光和电化学检测器可达 0.1pg。柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化
4、合物。样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。三、色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC) 。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC 根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以 GLC 应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC 同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用 CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。按原理分为
5、吸附色谱法(AC)、分配色谱法 (DC)、离子交换色谱法 (IEC)、排阻色谱法(EC ，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法,此外还有电泳。按操作形式可分为纸色谱法 (PC)、薄层色谱法(TLC) 、柱色谱法。四、色谱分离原理高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。1液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度 510m。适用于分离分子量2001000 的组分
6、，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。2液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如 C18、C8 、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同
7、可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC) 。正相色谱法采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相 )；流动相为相对非极性的疏水性溶剂 (烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。反相色谱法一般用非极性固定相（如 C18、 C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC 在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个 HPLC 应用的 80%左右。随着柱填料的快速发展，
8、反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的 pH 值。但需要注意的是，C18 和 C8 使用的 pH 值通常为 2.57.5（28 ），太高的 pH 值会使硅胶溶解，太低的 pH 值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在 pH 1.510 范围操作。正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法 反相色谱法固定相极性 高中 中低流动相极性 低中 中高组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。3离子交换色谱法固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与
9、二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的 pH 值和离子强度影响。pH 值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核
10、酸。4离子对色谱法又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。离子对色谱法常用 ODS 柱（即 C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入 310 mmol/L 的离子对试剂，在一定的 pH 值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其 pH 值
11、、离子强度有关。5排阻色谱法固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。II基本概念和理论一、基本概念和术语1色谱图和峰参数色谱图(chromatogram)-样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。基线(base line)-经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴
12、。噪音(noise)-基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。漂移(drift)-基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。色谱峰(peak)-组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯 Gauss 曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(s
13、ymmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。中国药典规定 T 应为 0.951.05。T 0.95 为前延峰，T1.05 为拖尾峰。峰底-基线上峰的起点至终点的距离。峰高(peak height ， h)-峰的最高点至峰底的距离。峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W4半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。Wh/22.355标准偏差（standard deviation，)-正态分布曲线 x1 时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607 倍处。标准偏
14、差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。 小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之， 大，峰形胖、柱效低。峰面积(peak area，A)- 峰与峰底所包围的面积。2定性参数（保留值）死时间(dead time，t0)-不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相 HPLC 中可用苯磺酸钠来测定死时间。死体积(dead volume，V0)- 由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括 4 部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有 Vm 参与色谱平衡过程，其它 3 部分只起
15、峰扩展作用。为防止峰扩展，这 3 部分体积应尽量减小。V0Ft0（F 为流速）保留时间(retention time，tR)- 从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。保留体积(retention volume，VR)-从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VRFtR调整保留时间(adjusted retention time，tR)-扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reduced retention time)。在实验条件（温度、固定相等）一定时，tR 只决定于组分的性质，因此， tR（或 tR）可用于定性。tRtRt0调整保留体积(adjusted retention volume，VR)-扣除死体积后的保留体积。3柱效参数理论塔板数(theoretical plate number，N)-用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。N 取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。N 与柱长成正比，柱越长，N
