微生物负载-杨京生

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1、 中国医药集团总公司 China National Pharmaceutical Group Corporation 中国生物技术股份有限公司 上海上海 2012 2012 年年 9 9月月 2 2日日 武汉生物制品研究所有限责任公司武汉生物制品研究所有限责任公司 杨京生杨京生 大规模动物细胞培养中微生物负大规模动物细胞培养中微生物负 载的综合防治载的综合防治 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 目 录 1 2 3 微生物负载的来源微生物负载的来源 概述概述 微生物负载防治的进展微生物负载防治的进展 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 一、概

2、述 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 细胞培养过程中，微生物污染的防治是一个永恒 的话题 。 细菌 真菌 支原体 病毒 很多病毒性疫苗产品，其病毒大于0.22 m，病毒 收获液不能进行终端过滤，终产品的无菌必须依 赖于每一步操作的无菌控制 提高收获率，降低生产成本，必须控制微生物污 染 。 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 规模性污染对生产造成极大影响：成本，环境， 生物安全； 环境监测计划（EMP）主要关注了微生物量的变 化，对质（种属）的变化无从了解； 对污染微生物进行种属分析，以判断其可能来源 以及制定相应防范措施； 目前常规方法（

3、革兰氏染色）不能达到目的； 现有无菌试验的滞后效应（14天），不能及时监 控及指导生产； 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 微生物负载防治是生物反应器细胞培养过程最重 要的一环 生物反应器细胞培养的优点： 高细胞浓度，可以达到107个/ml，是转瓶生产方式的3050倍； 设备占地面积小、生产规模大； 培养速度快、生产效率高；？ 生产机械化，易于自动控制； 培养设备密闭，无菌操作少，不易污染；？ 副产物少，有利于产物提取；？ 产品均一性好，质量稳定。 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 反应器细胞培养的微生物风险高于传统转瓶工艺 细胞培养 转

4、瓶培养：高无菌操作次数，低无菌操作集中度； 反应器培养：低无菌操作次数，高无菌操作集中度。 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 国外某些公司的反应器细胞培养状况国外某些公司的反应器细胞培养状况 A 公司 年份年份 最大最大 批次批次 A 最大产量最大产量 B 最大单最大单 产产 C=B/A 计划批计划批 次次 D 实际完实际完 成成 批次批次E 失败批失败批 次次 F 实际产量实际产量 G 实际单产实际单产 H=G/E 计划完成计划完成 率率 I=E/D 实际培养实际培养 成功率成功率 J=E/（E+F） 实际单产实际单产 率率 K=H/C 2006 20 10*10

5、6 5*105 20 16 8 3*106 1.8*105 80% 67% 36% 2007 20 17 2 6*106 3.5*105 85% 89% 70% 2008 20 16 6 4*106 2.5*105 80% 73% 50% 2009 20 14 2 4.5*106 3.2*105 70% 88% 64% 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 B 公司 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 微生物负载的防治微生物负载的防治 能够在发现微生物负载后，最快时间内鉴定此微生物的种 属； 根据其生物学属性，判断其可能来源，最终找到微生物的

6、真正来源； 这采取针对性措施，保证同样的错误不再发生； 通过一段时间的检测，进行统计学分析，找到整个生产流 程中出现微生物负载的高风险点，以及各个风险点不同的 微生物种类； 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 从而针对性的改进工艺和操作，提高产品质量。 快速微生物检测的应用，加快生产周期，提高半成品，成 品合格率； 通过微生物综合防治，促进生产成本的降低及检验水平的 提高；提高经济效益。 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 二、微生物负载的来源 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 微生物负载的来源微生物负载的来源 操

7、作人员： 无菌操作的失误率； 是否严格执行SOP； 异常情况的出现。 细胞培养原材料： 细胞种子，病毒种子； 培养基； 血清。 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 设备及公用设施： 是否严格执行SOP； 设备及公用设施异常； 日常维护不到位。 生产环境： 洁净区的维护； 与人，设备因素的相互作用。 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 污染微生物的鉴定方法污染微生物的鉴定方法 PCR法扩增16srDNA(原核微生物)和ITS(真核微生物)基因 16SrDNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列 ，存在于所有细菌的染色体基因中，也存在

8、于衣原体、立克 次体等原核生物中，但不存在于病毒、真菌等非原核生物中 。 16SrDNA基因高度保守，但其保守性是相对的，在保守区 之间存在着9或10个变异区，保守区和可变区相交错排列， 不同细菌都有不同程度的差异，可设计不同引物以所有细菌 或特定细菌进行PCR检测。 核糖体基因内转录间隔区(ITS)：用于鉴定真菌的基因序 列，高度保守但也有一定的可变性。 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 研究路线研究路线 微生物污染发生 采样，分离培养，获得纯培养的微生物， 染色，镜检，初步了解其特性（G+,G-，真菌） 提取微生物的基因组DNA，提取方法的研究与优化 PCR扩增

9、保守序列（16SrDNA，ITS），引物，反应条件的优化 扩增片段序列测定 与GENBANK比对，确定种属，系统进化树的建立 根据微生物的种类，确定其最常见的生长环境，针对性的采样（空气 ，水，器具，原材料，人员等） 同上分离培养，PCR，测序，比对 确定微生物的来源 针对性的进行工艺的改进 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 照片照片 葡萄球菌 巴氏葡萄球菌 表皮葡萄球菌 科氏葡萄球菌 蜡样芽孢 杆菌 蜡样芽孢杆菌 苏云金芽孢杆菌 微球菌 南极微球菌 氧化微 杆菌 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 类芽孢杆菌 奇异变形杆菌 玫瑰库克氏菌

10、库克氏菌 假单胞菌 缺陷短波单胞菌 红平红球菌 产碱菌 短短芽孢杆菌 不动杆菌 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 生产中污染菌分离 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 结结 论论 生产过程出现的污染微生物不是随机分布的，而 是集中在若干个种类； 不同污染微生物在生产的不同阶段出现； 不同污染微生物有季节分布现象； 不同污染微生物的来源不同，对生产的危害性也 不同，防治方法也不尽相同。 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 三、微生物负载防治的进展 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 过程分析

11、技术过程分析技术 PAT技术在生物制药领域的应用 过程分析技术（Process Analytical Technology，PAT） ：一 个系统，即作为生产过程的分析和控制，是依据生产过程 中的周期性检测、关键质量参数的控制、原材料和中间产 品的质量控制及生产过程，确保最终产品质量达到认可标 准的程序。PAT技术大致分为：多变量数据获得和分析工 具，现代工艺过程分析工具，工艺过程、终点监控和控制 工具，持续性改进和信息管理工具。 PAT技术在前几年就被用于精细化工产品的分析与制备， 但这几年国际上正逐渐应用于制药工业。 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 活细胞浓度

12、在线分析仪 ： 实时记录和显示细胞生长状态，监控细胞培养液 中的细胞密度，明显减低人工取样过程中的交叉 污染，减少劳力和人为错误，从而优化生产和缩 短研发过程，提供生产水平、质量和数据的可追 溯性。 微生物污染的早期发现。 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 在线生化分析仪： PH DO 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 一次性产品的应用一次性产品的应用 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 提高工艺操作的可扩展性：通过快速切换批次， 提高生产效率； 节约清洁时间； 减少批次间交叉污染的风险； 促使产品快速上市； 减

13、少验证的时间和成本； 减少废水的排放。 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 无菌接管技术代替人工无菌操作无菌接管技术代替人工无菌操作 封管机，接管机 一次性无菌接头 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 无菌传输系统 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 快速微生物方法快速微生物方法 2003年10月23日，PAT小组委员会会议提出了PAT技术报告 33号 主要内容是关于评价、确认和实施新的微生物检查法和 PAT中快速微生物检查法的作用，并召开了PAT倡议中快速 微生物方法（RMM）作用的讨论会。 关爱生命 呵护健康 国

14、药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 由于生产过程和产品出厂的微生物检验的周期太长，即使 采用最优的生产工艺、化学和物理替代方法监控生产过程 以减少产品生产和出厂周期也是不可能的。 例如，无菌产品的配液、无菌过滤和无菌分装一般只需1- 2天，而无菌试验时间却需要14天。不依赖于微生物生长 的快速检查法的到来预示着减少产品微生物负载的风险和 缩短产品出厂周期机会的来临。 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 快速微生物方法快速微生物方法 美国药典与欧洲药典均已有专门章节讨论其验证 的要点（USP1223，2005；EP5.1.6，2004） 我国即将发布的2010版药典

15、中，专门增加了一个 章节，为“药品微生物检验替代方法验证指导原 则” 随着微生物学的迅速发展，制药领域不断引入了一些新的微生物检 验技术，大体可分为三类： 基于微生物生长信息的检验技术，如生物发光技术、电化学技术、 比浊法等； 直接测定被测介质中的活微生物的检验技术，如固相细胞技术法、 流式细胞计数法等； 基于微生物细胞所含有的特定组成成分的分析技术，如脂肪酸测定 技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 这些方法与传统检查方法比较，或简便快速， 或具有实时或近实时监控的潜力，使生产早期采 取纠正措施及监控和指导优良生产成为可能，同 时新技术的使用也促进了生产成本降低及检验水 平的提高。 关爱生命 呵护健康 国药中生国药中生 CNBG 中国医药集团 快速微生物方法（快速微生物方法（ATPATP法）的建立及其法）的建立及其 在生产过程监控中的应用在生产过程监控中的应用 利用细胞的特征来测定细菌数，是快速检测细菌的一个发 展方向。 三磷酸腺苷（ATP）是所有生物细胞中一种活性物质。它 的三个磷酸根是靠高能量接在腺苷分子上的，分解