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1、GB4789.38-2012 大肠埃希氏菌计数,技术支持 田亮,广东微生物研究所 广东环凯微生物科技有限公司,大肠杆菌的定义,广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5发酵乳糖产酸产气、 IMViC生化试验 (靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐)为+ + - -或- + - -的革兰阴性杆菌。,卫生学意义,大肠杆菌的某些菌株对人有致病性。 相对于大肠菌群和粪大肠菌群，大肠杆菌与粪便污染的相关性最好，是指示粪便污染最理想的指标，应用也最悠久。自1892年被提议作为粪便污染的指示菌以来，已被应用了100多年 。 为什么后来又有了大肠菌群和粪大肠菌群的应用？主要的原因是因为大肠杆菌的检验过于复杂
2、。,随着食品卫生标准的日益科学和细化，以及对大肠杆菌检验方法的不断改进，对特定食品的大肠杆菌的检验需求肯定会越来越多。 可作为评价消毒效果的指示菌。,大肠杆菌的生化特性,形态与染色： 革兰染色朱阴性无芽胞的短小杆菌；多数菌株有58根鞭毛，能运动。少数菌有荚膜。 培养特性： 需氧或兼性厌氧。最适温度37，但在46也能生长。最适pH7.47.6。,大肠埃希氏菌计数 GB 4789.38-2012,“大肠杆菌VRBAMUG平板计数”改为“大肠 埃希氏菌平板计数法” 删除大肠杆菌PetrifilmTM测试片计数法,GB478.38-2012大肠杆菌计数,第一法：MPN法 第二法：大肠埃希氏菌平板计数法
3、,GB4789.38-2012 第一法 大肠杆菌计数MPN法,GB4789大肠杆菌计数MPN法检验程序,检样25g(ml)+225ml稀释液，均质,10倍稀释,选择3个连续稀释度样品匀液接种LST,482h,361,不产气,产气,EC肉汤,44.50.2,482h,不产气,产气,EMB琼脂平板,361,18h-24h,营养琼脂斜面培养,I M Vi C生化试验，革兰染色,查MPN表，报告,样品的稀释,固体和半固体食品：称取25g样品，放入盛有225 mL生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，于800010000 r/min均质1min2min，或放入盛有225 mL生理盐水的无菌均质袋中，用均
4、质器拍打1min2min，制成1:10的样品匀液。 样品匀液的pH值应在6.57.5之间，必要时分别用1.0mol/L氢氧化钠或1.0mol/L盐酸调节。,用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁徐徐注盛有9mL磷酸盐缓冲液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用一支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至接种完毕，全过程不得超过15min。,初发酵试验,选择适宜的三个连续稀释度的
5、样品匀液（液体样品可以选择原液）。每个稀释度接种3管LST肉汤，每管接种1mL（如接种量需要超过1 mL，则用双料LST肉汤），361培养24h2h，观察小导管内是否有气泡产生，如未产气继续培养至48h2h。记录在24h48h内产气的LST管数。如所有LST肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN结果；如有产气者，则进行复发酵试验。,复发酵试验,用接种环分别从所有48h2h内发酵产气的LST管取培养物1环，移种到已提前预温至45的EC肉汤管中，放入带盖的44.50.2水浴箱内，水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h2h，检查小导管内是否有气泡产生，如未产气继续培养至48h2h。记录在24h和
6、48h内产气的EC肉汤管数。如所有EC肉汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN结果。如有产气者，则进行EMB平板分离培养。,伊红美蓝平板分离培养,轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物划线分离于伊红美蓝（EMB）平板。361培养24h2h后，检验平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。,营养琼脂斜面或平板培养,从每个平板上挑选5个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，36 1培养18h24h，取培养物进行革兰染色和生化试验。,生化试验,靛基质试验：将培养物接种于蛋白胨水，361培养24 h2h，加Kovacs靛基质试剂0.20.3ml，上层
7、出现红色为阳性。 MR-VP试验：将培养物接种于MR-VP培养基，361培养48h2h，移取培养物1ml至13mm100mm小试管中，加5%-萘酚乙醇溶液0.6ml、40%氢氧化钾0.2ml和少许肌酸结晶。振摇后静置2h，如出现伊红色为VP试验阳性。,将MR-VP试验剩余培养物再培养48h后，滴加5滴甲基红试剂，培养物变红为甲基红试验阳性；变黄为阴性。 柠檬酸盐利用试验：将培养物接种于Koser氏柠檬酸盐肉汤， 361培养96h2h，记录有无细菌生长，生长为阳性。,大肠杆菌与非大肠杆菌的生化鉴别,大肠杆菌MPN计数的报告,大肠杆菌为革兰染色阴性无芽胞杆菌、发酵乳糖、产酸、产气；MIViC试验为
8、+-或-+-。只要有1个菌落鉴定为大肠杆菌，其代表的LST肉汤管即为大肠杆菌阳性。 依据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每g或每ml样品中大肠杆菌MPN值。,EC肉汤,EC肉汤主要成分：乳糖、胆盐、胰蛋白胨。 大肠杆菌因分解乳糖而产气，使小导管中可见气泡。,EC肉汤结果判定 44.5 0.2培养,接种前的EC肉汤,产气为阳性,不产气为阴性,EMB琼脂上大肠杆菌的典型菌落 与可疑菌落,典型菌落：具黑色中心有光泽或无光泽的菌落。 非典型的可疑菌落：粉红色，无黑心,典型的大肠杆菌的菌落,非典型的大肠杆菌的菌落,MIViC试验原理,甲基红试验(I )原理：本试验是用甲基红指示剂测定细菌发酵葡萄糖时产
9、生的氢离子浓度的试验。大肠杆菌和大肠菌群能分解葡萄糖产生大量酸性产物，使甲基红指示剂变为红色。 注意：培养时间不得48h；接种菌量浓度不宜过大，否则细菌生长受抑制，因此，接种量、试管大小应尽量标准化，否则影响结果判定及重复性差,靛基质试验(M)原理：细菌(如大肠埃希菌、大肠菌群等)含有色氨酸酶，将蛋白胨中的色氨酸分解，生成靛基质。靛基质与对二甲基苯甲醛作用，形成红色的玖瑰靛基质(红色的醇层，为醌型结构的红色集约化化合物)，呈红色。 注意： 蛋白胨的色氨酸含量与靛基质试验阳性反应密切相关，若蛋白胨水中加入0.21%的色氨酸或选用色氨酸高的胰蛋白胨做靛基质试验效果更佳。,VP试验(Vi)原理：本试
10、验是检查细菌利用葡萄后所产生的代谢终产物乙酰甲基甲醇的实验。细菌在葡萄糖代谢中生成丙酮酸，丙酮酸仅是中间产物。随细菌种属不同而有多种分解途径，使丙酮酸进一步分解为不同的终产物，借此鉴定菌种。 注意： 在加入试剂时一定要加-萘酚，使其先与丁二酮和胍基复合物结合，而后再加入40%氢氧化钠。,若先加入40%氢氧化钠溶液，氢氧化钠可与培养基中蛋白胨某些成分反应，产生橙红色，造成假阳性的结果。 40%氢氧化钠溶液的加入量不超过0.2ml，如过量可与-萘酚反应出现棕色，使弱阳性结果不易观察。 若已知的阳性菌株，偶不出现阳性反应时，可把含V-P试剂的培养物轻微加热株，阳性菌经加温后一般即可产生阳性反应。而阴
11、性菌株仍为阴性反应。,在V-P试验中，为检出最小量乙酰甲基甲醇的最显著变化，结果观察可延至1h，但要注意氢氧化钠对-萘酚的作用，不要将棕色错判为阳性结果。也可将试验管置35培养4h后再观察结果，若无红色出现，即为阴性。,柠檬酸盐(枸橼盐)试验(C)原理：某些细菌可利用柠檬酸盐为碳源，同时利用铵盐为氮源提供能量而生长。 注意：本试验是以细菌生长后培养基的浊度判定结果的。因此接种待试培养物过多时，容易造成假阳性结果。一般宜采用灭菌生理盐水制成菌悬液接种为好。,I M Vi C试验的最佳观察结果时间,靛基质试验：361，24h 2h； 甲基红试验：361，4d；滴加甲基红试剂，出现红色为阳性；出现黄
12、色为阴性结果。 V-P试验： 361，48h 2h；滴加试剂后若未出现伊红色，应再培养2h后再观察结果。 柠檬酸盐试验： 361，96h 2h；观察有无细菌生长。有细菌生长培养基可变为蓝色。,大肠杆菌-I M Vi C 试验,靛基质试验,甲基红试验,V-P试验,柠檬酸盐试验,GB4789.38-2012 第二法大肠埃希氏菌平板计数法,原理,4-甲基伞形酮-D-葡萄糖苷，英文缩写 MUG。是一种不产生荧光的底物。由于96%的大肠杆菌都具有葡萄糖苷酶，能分解-D-葡萄糖苷，而使4-甲基伞形酮游离出来，在366nm紫外光下产生蓝色荧光。观察到蓝色荧光即可认为是大肠杆菌阳性。 MUG对大肠杆菌的生长繁
13、殖既没有抑制作用也没有促进作用，对菌落形态也没有影响。,对VRBA-MUG平板计数法的评估,优势： 许多研究结果都证实，MUG方法的可靠性是相同于或高于常规MPN方法，准确性高于疏水格滤膜法。 当普通变形杆菌等背景菌或杂菌存在时，对大肠杆菌发酵乳糖的产气能力具有抑制作用，但对分解MUG产生荧光的能力没有抑制作用。,研究还证实，大肠杆菌的荧光反应比产气反应出现得更早，并且不受食品的影响，目前，仅发现对牡蛎不适合用MUG方法，因为牡蛎具有内源性葡萄糖苷酸酶。,本方法是通过荧光的产生判定结果的，实验过程中所使用的器皿易受洗涤剂中的荧光增白剂的影响，而产生假阳性或阴性对照显荧光的现象。 需在紫外灯下观
14、察结果与计数，时间太长对人的眼睛有损伤，实验时需特别的安全防护 。 利用大肠杆菌能产生-葡萄糖苷酸酶的特性进行检验的方法除了MUG以外，还有5溴-4氯3吲哚-D葡糖苷酸等。,平板计数法检验程序,检样25g(ml)+225ml稀释液，均质,10倍系列稀释,选择23个适宜稀释度的样液， 接种VRBA-MUG平板,紫外光下，计数发荧光的菌落,报告结果,361,1824h,检验,选取23个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度分别取1mL注入两个无菌平皿。 另取1mL样品稀释液注入一无菌平皿中，作空白对照。 将预热至45士0.5的结晶紫中性红胆盐琼脂10 mL15mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将
15、培养基与样品匀液充分混匀。 待琼脂凝固后，再加3 mL4mL VRB-MUG覆盖平板表层。 凝固后翻转平板，361培养18 h24h。 注：空白对照不加VRB-MUG覆盖。,大肠杆菌平板计数与报告,选择菌落数为10100的平板，暗室中360nm366nm波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。 两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每克(或毫升)样品中大肠杆菌数，以cfu/g(mL)表示。,大肠杆菌在VRBGA-MUG 平板上的典型菌落,ISO 16649-2:2001 5溴-4氯3吲哚-D-葡萄糖苷酶显色培养基技术,原理：葡萄糖苷酶阳性的大肠杆菌经44培养18h24h后，分
16、解酶底物中的葡萄糖苷，使5溴-4氯3吲哚游离形成蓝绿色的菌落。,显色培养基平板计数法检验程序,检样25g(ml)+225ml稀释液，均质,10倍系列稀释,选择23个适宜稀释度的样液， 接种TBX平板,计数蓝绿色的菌落,报告结果,44,1824h,样品的制备,试验样品的制备：参考ISO 6887-1和产品相关的具体国际标准。,接种,使用无菌吸管或移液器(6.5)，吸取1ml液体样本或1ml其它样本的初始悬浮液(10-1)，转移至无菌平皿中。 每一稀释度接种二块平皿。 如有必要，重复上述操作接种样本的更高稀释度，每接种一个稀释度更换一支无菌吸管。 在接种后的平皿中倾注15ml事先在水浴箱中冷却至4447的TBX培养基 。,小心将培养基和接种物混匀，并将平皿放在冷的水平面上待其凝固。 从接种到倾注培养基不
