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1、FDA沙门氏菌检验标准中文版（一）U.S. Department of Health and Human Services U.S. Food & Drug AdministrationCenter for Food Safety & Applied NutritionBacteriological Analytical Manual April 2003 沙 门 氏 菌 检 测FDA分析手册(2003年3月)第5章章节内容1、 简介2、 设备和材料3、 培养基和试剂4、 样品的制备5、 沙门氏菌的分离培养6、 沙门氏菌的鉴定7、 快速检测方法(附录1)8、 参考文献简介在第8版的BAM手册中
2、，沙门氏菌的检测方法有了几个改变。第一个改变是RV培养基的广泛使用，即可用于检测含沙门氏菌量高的食品，又可于检测含沙门氏菌量低的食品，以前的版本中，RV培养基仅用于虾类的检测。依据AOAC反复研究的结果，RV培养基即可用于检测含沙门氏菌量高的食品，又可于检测含沙门氏菌量低的食品。除口香糖外的所有食品，RV培养基替代了SC培养基。此外，RV培养基取代了必须含有活性干酵母的LST肉汤培养基。TTB肉汤继续用于第二种选择性增菌培养基，包括口香糖在内的食品，在检测含菌量高的食品时需进行43培养；在检测含菌量低的食品时需进行35培养。第二个改变是对于冷藏食品前增菌和低水份食品选择性增菌培养的时间为72小
3、时以内，这样，样品检测的时间最迟星期三或星期四可以开始，周末也不用加班。第三个改变是缩短了在LIA斜面上的培养时间，在以前的版本(BAM-7)中，TSI和LIA斜面在35培养的时间分别为242h和482h。未公布的一些资料表明，48小时后观察LIA斜面结果是没有任何诊断价值。对193个LIA斜面进行试验，培养242h后，所有的斜面都给出了正确的结果。再培养24h后，试验的结果没有什么重大的改变。所以，TSI和LIA斜面培养基现在改为培养242h。第四个改变是蛋壳表面灭菌步骤的改变。在以前的版本(BAM-7)中，蛋壳表面灭菌的方法是在0.1%的HgCl2溶液中浸泡1h，然后在70%的乙醇溶液中浸
4、泡30分钟。HgCl2对人体是有害的，依据环境保护组织的要求进行处理，费用是非常昂贵的。在新版的手册（BAM-7）中，蛋壳表面的消毒只需通过浸泡在含0.1%SDS的次氯酸钠溶液(含Cl-200PPM)中30分钟。第五个改变是蛋类样品的制备。在检测前，蛋的内容物(蛋黄和蛋白)需进行完全混匀。之后，取25ml加入含硫酸铁的胰酪胨大豆肉汤中。本版中，制定了口香糖的检测方法。口香糖样品和增菌肉汤以1：9的比例进行混合，得到的混合物非常粘，不易被吸管吸出。另外添加纤维素酶时，容易被吸管吸出。由于最近桔子汁相关事件的发生，其检验方法也己制定出，被检的桔子汁包括经巴氏消毒和未经巴氏消毒的。从选择性平板上挑菌
5、落说明更明白和科学。如果在选择性平板上没有可疑的典型菌落，建议挑取几个非典型菌落接种到TSI和LIA培养基上。由于在过去的几年里，FDA的科学家们从一些食品中，特别是从海产品中分离出沙门氏菌，其中4%左右在选择性平板是非典型菌落。最后，自成BAM-7发行以来，已经制定出6种培养基的使用说明。包括3种选择性培养基（BS琼脂、HE琼脂和XLD琼脂）和3种比较新的培养基(EF-18、XLT、Rambach 琼脂)。我们的实验结果证实，用一种或几种新的培养基来取代BAM中推荐的培养基是不理想的。因些，我们一直保留下来。A、设备和材料1、 搅拌器和无菌搅拌杯2、 无菌500ML广口螺口三角瓶、无菌500
6、ML长颈三角瓶、无菌250ML烧杯、无菌玻璃漏斗、无菌采样器3、 无菌玻璃涂布捧或塑料涂布捧4、 电子天平，精度0.1g，最大量称2000g5、 电子天平，精度5mg，最大量称120g6、 培养箱：3527、 冰箱：428、 水浴箱：4919、 循环的、温度可调的水浴箱：430.210、循环的、温度可调的水浴箱：420.211、无菌药匙或其它合适的工具：用于称样品12、无菌培养皿：15X100MM，玻璃或一次性的13、1ml无菌吸管,刻度0.01ml、5ml和10ml无菌吸管,刻度0.1ml14、接种针和接种环15、无菌试验试管或培养试管：16X150MM和20X150MM血清学鉴定管：10X
7、75MM或13X100MM16、试管架17、旋转混合器18、无菌剪刀、大剪刀、解剖刀及镊子19、灯：用于观察生化反应20、电炉21、PH试纸：PH值6-8，最大变色范围在0.4PH单位22、PH计23、28X37CM的无菌塑料袋，易拉口(在第23-24节中，检测蛙腿和兔体时用)24、塑料烧杯：能耐高温高压，用于振荡培养过程中，固定塑料袋B、培养基和试剂1、 乳糖肉汤(M74)2、 脱脂奶粉(M111)3、 SC肉汤(M134)4、 TTB肉汤(M145)5、 RV培养基(M132)6、 XLD琼脂(M179)7、 HE琼脂(M61)8、 BS琼脂(M19)9、 TSI琼脂(M149)10、色氨
8、酸肉汤(M164) 11、胰酪胨大豆肉汤(M154)12、含硫酸铁的胰酪胨大豆肉汤(M186)13、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(M76)14、胰酪胨示胨大豆肉汤(M160)15、MR-VP肉汤(M104)16、西蒙氏枸橼酸盐培养基M13817、尿素肉汤(M171)18、尿素肉汤(快速)(M172)19、丙二酸钠培养基(M92)20、LIA培养基(M89)21、赖氨酸脱羧酶肉汤(M87)22、动力培养基(M103)23、KCN培养基(M126)24、苯酚红糖类发酵肉汤(M121)25、紫色糖类发酵肉汤(M130)26、麦康凯琼脂(M91)27、营养肉汤(M114)28、BHI肉汤(M24)29、5
9、%木瓜蛋白酶溶液(M56a)30、1%纤维素酶溶液(M187)31、月示胨羊血琼脂基础(M166)32、通用前增菌肉汤(UPM,M188)33、无水亚硫酸钾粉末34、200ppm次氯酸钠溶液，含0.1%SDS(R12a)35、70%乙醇溶液(R23)36、靛基质试剂(R38)37、V-P试剂(R89)38、肌酸晶体39、40%KOH溶液(R65)40、1N NaOH溶液(R73)41、1N HCl溶液(R36)42、1%煌绿溶液(R8)43、溴甲酚紫溶液,0.2%(R9)44、甲基红指示剂(R44)45、无菌蒸馏水46、Tergitol-7(R78)47、Triton X-100(R86)48
10、、0.85%生理盐水(R63)49、适当浓度的生理盐水(R27)50、沙门氏菌多价O血清51、沙门氏菌多价H血清52、沙门氏菌多价O群血清：A、B、C1、C2、C3、D1、D2、E1、E2、E3、E4、F、G、H、I、Vi和其它相应血清53、沙门氏菌Spicer-Edwards H血清C、样品制备以下的方法均以25g样品作为抽检单位，样品与肉汤培养液的比例为1:9。根据样品的组成成份不同，添加足够的肉汤培养基保持1:9的比例，除非特殊说明，例如，蛙腿等不需准确称量检测的样品，需采用特殊的方法。1、干蛋黄、干蛋白、干全蛋、液体牛奶(脱脂牛奶、含2%脂肪牛奶、全牛奶和脱脂奶粉)，粉状调制食品(蛋糕
11、、甜饼、炸面圈、饼干和面包)、婴儿食品、口食或软管进食的含蛋食品。检验前的冷冻食品最好不要解冻。如果冷冻样品必须软化来获得待检部分，尽可能缩短解冻的时间，使竟争菌群生长最少，并减小对沙门氏菌的损伤。解冻需在45以下进行，置于能自动控温的水浴锅内，不断搅拌15分钟或在2-5解冻18小时。无菌称取25克样品，放入无菌带螺旋帽的广口瓶中(500ML)或其它合适的容器内。对于非粉末状的样品，加入225ml无菌的乳糖肉汤；对于粉末状的样品，先加入约15ml无菌的乳糖肉汤，用无菌的玻璃捧、药匙或舌状器具搅拌，使其均匀悬浮，再加入3份无菌乳糖肉汤，分别为10ml、10ml和190ml,使总量为225ml。充
12、分搅拌，直到样品完全悬浮，没有块状物。小心地盖紧瓶盖，室温静置605min。振荡混匀，用PH试纸测PH值，如果需纠正PH值，用无菌1N NaOH或1N HCl调PH值至6.80.2。把瓶盖松开约1/4圈，置于35培养242h。以下试验按D,1-11进行。2、蛋类a、 含壳蛋。用硬刷子洗蛋并使其干燥，然后浸泡于含0.1%SDS的200ppm 氯离子溶液中30分钟。此溶液的配制如下：取8ml 5.25%的次氯酸钠溶液和1gSDS加入992ml蒸馏水中溶解即可。这种消毒液需在使用前配制。无菌打开蛋壳置于无菌的容器内，用无菌的药匙或其它工具混合蛋清和蛋黄。无菌称取25g于无菌的三角瓶中或其它合适的容器
13、内，加入225ml含硫酸铁的TSB肉汤(1L TSB中加入35mg硫酸铁)，混匀，室温静置605min。振荡混匀，用PH试纸测PH值，如果需纠正PH值，用无菌1N NaOH或1N HCl调PH值至6.80.2。置于35培养242h。以下试验按D,1-11进行。b、液全蛋（均匀状）。无菌称取25g于无菌的三角瓶或其他适宜的容器内，加入225ml含硫酸铁的TSB充分摇匀，按上面的方法继续。c、 煮硬的蛋（鸡蛋、鸭蛋或其他种类的蛋）。如果蛋壳完整，向上述方法进行消毒，无菌分离蛋壳，弄碎蛋黄和蛋白，称取25g与无菌的500ml的锥形瓶中或其他的容器内，加入225mlTSB，并且摇匀，按上述方法继续。3
14、、脱脂干奶粉a、 速溶型。无菌称取25g样品于无菌的烧杯或其他适宜的容器内，用灭菌的玻璃或纸质的漏斗（用带卷好以便高压灭菌）将样液25ml慢慢注入灭菌的500ml的含225ml的煌绿水的锥形瓶中或其他适宜的容器内，使样液覆盖在煌绿水的表面，也可多个25g检测单位混合倒入含有相应比例煌绿水的容器内，使样品覆盖在煌绿水的表面，按每1000ml灭菌蒸馏水中加入2ml2%的煌绿溶液进行配制，将样品容器室温静置605min，旋松塞子，不需混匀和调整PH，35培养242h，按D1-11继续。b、 非速溶。按上述速溶脱脂干奶粉的检测方法进行，但不允许将多个25g样品检测单位混合。4、全脂奶粉。按上述速溶脱脂
15、干奶粉的检测方法进行，但不允许将多个25g样品检测单位混合。5、酪蛋白a、 乳酪。无菌称取25g样品于无菌的250ml烧杯或其他适宜的容器内，用灭菌的玻璃或纸质的漏斗（用带卷好以便高压灭菌）将样液25ml慢慢注入灭菌的500ml的含225ml的普通肉汤的锥形瓶中或其他适宜的容器内，使其覆盖在普通肉汤的表面，也可多个25g检测单位混合倒入含有相应比例普通肉汤的容器内，使样品覆盖在普通肉汤的表面，将样品容器室温静置605min，旋松塞子，不需混匀和调整PH，35培养242h，按D1-11继续。b、 凝乳酪。无菌称取25g样品于无菌的250ml烧杯或其他适宜的容器内，用灭菌的玻璃或纸质的漏斗（用带卷好以便高压灭菌）将样液25ml慢慢注入灭菌的500ml的含225ml的乳糖肉汤的锥形瓶中或其他适宜的容器内，使其覆盖在乳糖肉汤的表面，也可多个25g检测单位混合倒入含有相应比例乳糖肉汤的容器内，使样品覆盖在乳糖肉汤的表面，将样品容器室温静置605min，旋松塞子，不需混匀和调整PH，35培养242h，按D1-11继续。c、 咸乳酪。无菌称取25g样品于无菌的带螺旋帽的广口瓶中或其他合适的容器内，添加2
