巨胚米研究分析解析

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1、1 一个新巨胚等位基因的鉴定及性状考察与表达分析一个新巨胚等位基因的鉴定及性状考察与表达分析 平宝哲，时亚琼，谢米雪，张鑫，王鑫，张涛，李建粤平宝哲，时亚琼，谢米雪，张鑫，王鑫，张涛，李建粤* （上海师范大学 生命与环境科学学院，植物种质资源开发中心，上海 200234） 摘要：摘要：“超 2-10”水稻在离体培养过程中发生胚性状突变获得“上师大 5 号”巨胚水稻。本研究以“超 2-10”水 稻和“上师大 5 号”巨胚水稻为材料，分析了两 2 种水稻的胚重和、胚与糙米重量质量比、巨胚性状的遗传， 并克隆和分析了其中巨胚基因（GE）序列。结果显示， （1） “上师大 5 号”的胚重及、胚与糙米重

2、量质量比， 都极显著大于“超 2-10”水稻， “超 2-10”水稻的胚重接近或大于一些已报道的巨胚水稻。 （2） “上师大 5 号” 水稻巨胚表型由一对隐性基因控制，并与韩国巨胚稻“M-2-565-11-3-B(ge)”属于相同的等位基因突变。 （3） “超 2-10” 、 “上师大 5 号”和“M-2-565-11-3-B(ge)”三 3 种水稻各自具有一个新的 GE 等位基因， 它们的突变位点分别位于：只在启动子、启动子及编码链、只在编码链。 （4）在“上师大 5 号”水稻中， 启动子及编码链都有突变的 GE 等位基因（gec） ，在开花后 4 天至6 天 d，表达量呈现持续增加，完全不

3、 同于只有编码链突变的 GE 等位基因是呈持续下降的表达模式。本研究首次报道了突变只在启动子、突变 同时发生在启动子及编码链两种 2 种新型巨胚等位基因。 关键词关键词：巨胚基因， ；“上师大 5 号”水稻， ；“超 2-10”水稻， ；“M-2-565-11-3-B(ge)”水稻， ；新等位基因， ； 表达分析 全文口语化表达，不够精炼。建议科学严谨表达研究结果。 Molecular Characterization, Phenotype Investigation and Expression Analysis of a New Giant Embryo Allele PING Baozh

4、e, SHI Yaqiong, XIE Mixue, ZHANG Xin, WAN Xin, ZHANG Tao, LI Jianyue* （Development Center of Plant Germplasm Resources, College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, Peoples Republic of China） Abstract: “Shangshida No. 5” is a new variety of giant embryo rice

5、 derived from embryo character mutation in “Chao2-10” rice tissue culture operation. In this paper, we use “Chao2-10” and “Shangshida No. 5” rice as materials. The embryo weight and ratio of embryo to brown rice of “Shangshida No. 5” rice were compared with 基金项目：基金项目：本研究由上海市科委项目(063919141) 资助 作者简介：作

6、者简介：平宝哲（1988-） ，男，硕士，研究方向：分子遗传学与基因工程。E- mail： *通信作者：通信作者：李建粤，副教授，研究方向：分子遗传学与基因工程。E-mail: 2 those of “Chao2-10” rice. Then we did the genetic analysis of giant embryo phenotype. Giant embryo gene (GE) of “Shangshida No. 5” rice, “Chao2-10” rice and Korea giant embryo rice“M-2-565-11-3-B (ge)” were c

7、loned to analyse their sequence. The expression levels of GE gene in “Shangshida No. 5” rice, “Chao2-10” rice were analysed by Real time-PCR with the “Nipponbare” rice as a control. The results were as follows: (1) Both embryo weight and ratio of embryo weight to brown rice weight of “Shangshida No.

8、 5” rice was significantly larger than these of “Chao2-10” rice (P0.01). However, embryo weight of the “Chao2-10” rice is close to or more than some of the giant embryo rice cultivars reported previously; (2) Giant embryo phenotype of “Shangshida No. 5” rice is controlled by a single recessive gene,

9、 which is same to “M-2-565-11-3-B(ge)”; (3) GE gene in these three cultivars is a new GE allele: “Chao2-10” rice has a mutation (gep) in the promoter; “Shangshida No. 5” rice has mutations (gec) both in the promoter and CDS;“M-2-565-11-3-B(ge) rice only has a mutation (geh) in CDS; (4) The expressio

10、n level of the gec in young seed was different from other GE alleles reported, which increase steadily from 4 day to 6 day after flowering. This paper first reported two GE alleles, one is mutated in the promoter, the other has mutations in both promoter and CDS. . KeyKey wordword: Giant embryo gene

11、, ;“Shangshida No. 5” rice,； “Chao2- 10” rice,；“M-2-565-11-3-B (ge)” rice,； new allele, ；expression analysis 引言引言 近几年来随着人们对食品营养品质的追求，对功能性稻米的研究越来越为人所关注。巨胚稻是一种胚 变大的水稻突变体，其胚表型比正常的小胚水稻胚增大两倍 2 倍及以上。巨胚糙米中的-氨基丁酸 （GABA）1, -2、维生素 E1, 3-7、多种氨基酸1, 4, 7、谷维素1, 6、酚类1, 6和矿物质3, 6, -7的含量都显著高于 正常水稻的小胚糙米。 有文献报道，巨胚性状由隐

12、性单基因控制3, 8-11。钱前等10利用金南风/南京 11 F2群体对 金南风的巨胚基因(GE)进行了定位，将巨胚基因定位在第 7 染色体上 RG678 和 RZ395 之间，遗传距 离分别是 6.2cM 和 13cM10。Koh 等12利用Hwacheongbyeo-ges/ Milyang23 F2 群体，将巨胚基 因定位在第 7 染色体上的 RZ395 和 CD0497 之间，遗传距离分别为 2.4cM 和 3.4cM12。近年来，人们对 巨胚基因的进一步研究认为，巨胚基因（Os07g0603700）编码细胞色素 P450 家族中的一种蛋白3, 11, 13-16， 目前该蛋白被定名为

13、 CYP78B516。Chen 等16的研究表明，CYP78B5 蛋白在内质网和过氧化物酶体内完 3 成代谢过程，该蛋白的功能缺失会导致 IAA 水平急剧下降，影响细胞的分裂和膨大，从而导致了胚与胚 乳的比例改变16。 目前已被报道的 GE 等位基因有 ge-1、ge-2、ge-3、ge-4、ge-5、ge-6、ge-7、ge-8、ge-9、ge-1013、 get3以及“10217”巨胚稻11、 “Kita-ake”巨胚稻16中的 GE 等位基因，它们分别在不同地域的水稻品种 中被发现。虽然已有十多个巨胚等位基因被报道，但这些等位基因的突变都在编码链上。目前还不清楚对 于 GE 等位基因是否

14、会在编码链外也发生突变。 观察“超 2-10”的胚，虽然比不上现已报道的较多巨胚水稻品种1, 3, 6, 11, 14, 16，但比“日本晴”水稻 大。目前还不清楚“超 2-10”水稻的 GE 等位基因是否有突变。本实验室在将“超 2-10”水稻在成熟胚 离体培养时，曾发生胚表型突变，由此形成了一个胚显得更大的“上师大 5 号”水稻17。为了探索是什么 基因突变导致了“上师大 5 号”水稻的巨大胚表型的突变基因，本研究以“超 2-10”水稻和“上师大 5 号”水稻为材料，对“上师大 5 号”的巨胚性状及巨胚基因开展了研究。 1 1 材料与方法材料与方法 1.11.1 水稻材料水稻材料 “上师大

15、 5 号”是由“超 2-10”水稻在水稻组织培养环境中发生胚性状突变而获得的新巨胚水稻17。 “超 2-10”和“上师大 5 号”是本研究中两种 2 种最主要的水稻材料；为了分析“上师大 5 号”巨胚水稻 是否与目前已报道的其他巨胚水稻属于相同等位基因突变，本研究还选用由韩国“花晴”水稻突变得到的 巨胚稻“M-2-565-11-3-B(ge)”作为研究材料；为了对“上师大 5 号”巨胚基因的遗传规律进行分析，本 研究又选取了两种 2 种正常胚水稻：两系不育系“261S”水稻和常规旱稻“IRAT109”水稻作为试验材料。 取正常胚“日本晴”水稻作为采用体式显微镜观察“超 2-10”水稻、 “上师

16、大 5 号”水稻和“M-2-565-11- 3-B(ge)”水稻的对照材料。 1.21.2 水稻糙米及胚性状考察水稻糙米及胚性状考察 取“上师大 5 号”和“超 2-10”水稻的稻谷各 300 粒，分 3 组，每组 100 粒，按照朱映东等方法18 称量糙米百粒重、百粒胚重，并计算胚与糙米质量比。 选取“上师大 5 号”水稻、 “超 2-10”水稻、 “M-2-565-11-3-B(ge)”水稻和“日本晴”水稻具有代表 性的糙米，在 LeicaDFC290 体式显微镜下观察不同水稻糙米的胚大小并进行拍照。 1.31.3 “上师大上师大 5 5 号号”水稻水稻巨胚突变性状的遗传分析巨胚突变性状的遗传分析 以“上师大 5 号”巨胚稻为母本，分别与 3 种小胚正常胚水稻：“超 2-10” 、 “261S”和“IRAT109” 进行杂交。收获杂交 F1种子及从 F1植株上分单株收获 F2种