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1、1牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白 fimA 基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（一）论文关键词：牙龈卟啉单胞菌菌毛大肠杆菌表达系统融合蛋白固定化金属螯合亲和层析论文摘要：研究背景：慢性牙周炎在我国有很高的发病率，严重影响国民健康水平。慢性牙周炎不仅是导致成人牙齿功能丧失的主要原因之一，而且还可能是某些系统性疾病的危险因素。慢性牙周炎是一种细菌感染性疾病，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis,Pg）是其主要可疑致病菌。菌毛（fimbriae）是 Pg 的重要致病因子，可介导 Pg 附着于口腔内各种组织细胞的表面，以有利于Pg 在体内进一步的粘附和侵袭；可引发炎症反应和免疫反应。并
2、且菌毛具有良好的免疫原性，可诱导机体的保护性免疫应答。目前，慢性牙周炎的治疗效果还不理想，因此探索预防慢性牙周炎的有效途径具有重要意义。研究目的：本研究拟在大肠杆菌中表达 FimA 蛋白并进行蛋白纯化。为后续实验制备抗 FimA 蛋白的多克隆抗体提供实验基础。研究方法：1.以大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 为宿主菌，用 IPTG 诱导 fimA 表达，通过 SDS-PAGE 和 Westernblot 来验证蛋白的表达结果，并进行蛋白表达形式分析。2.大量诱导表达融合蛋白，用 Co2+柱亲和层析纯化表达产物，通过SDS-PAGE 和 Westernblot 来验证纯化产物，纯化产物经透
3、析复性后用 BCA 法蛋白定量试剂盒作蛋白含量测定。研究结果：1.经 IPTG 诱导表达后，工程菌在 SDS-PAGE 上出现一条新蛋白带，分子量与预期大小基本一致（约 41kDa） ，IPTG 浓度及诱导时间对融合蛋白表达量影响较大：当 IPTG 浓度为 2mmol/L，诱导时间为 3h 时蛋白表达量最大；当IPTG 浓度为 1mmol/L，诱导时间为 1h 时蛋白表达量最小。6His-FimA 表达产物经 SDS-PAGE 后，转移至硝酸纤维素膜，X 线片感光，在 X 线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，而空质粒 pET-15b 对应位置未见特异条带。蛋白表达形式分析结果表明表
4、达的融合蛋白位于包涵体中。2.表达产物经 Co2+柱亲和层析，SDS-PAGE 上出现一致的单一条带，其分子量大小与预期相符（约41kDa） 。6His-FimA 纯化产物经 SDS-PAGE 后，转移至硝酸纤维素膜，X 线片感光，在 X 线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，条带位置与BL21(DE3)pLysS 全菌诱导表达后相应蛋白位置一致。经 BCA 法蛋白浓度定量试剂盒对纯化后的蛋白质进行定量分析，计算出纯化后的 FimA 蛋白浓度为0.96mg/ml。主要结论：用本课题组前期构建的 fimA 基因的原核表达质粒 pET-15b-fimA，在大肠杆菌 BL21(DE3)pL
5、ysS 中诱导表达后，fimA 基因能够得到正确表达。表达产物经 Co2+柱亲和层析，可以得到带 6His 标签的 FimA 融合蛋白。21 绪论慢性牙周炎是导致成人牙齿功能丧失的主要原因之一，在我国有很高的发病率，严重影响国民健康水平。牙周炎造成的牙周组织的破坏是持续性的，一旦发生，目前的治疗手段还不能使牙周组织达到完全的恢复。牙周炎还可能是某些系统性疾病的危险因素。随着我国经济的发展、人民生活水平的提高和人群寿命的延长，对牙周健康状况的关注日益提高。因此，探索预防慢性牙周炎的有效途径对于提高国民健康水平具有重要意义。疫苗在人和家畜疾病防治方面具有极大的作用，是一种有效的防治疾病的手段。从减
6、毒活疫苗、死疫苗、亚单位疫苗、重组疫苗到 DNA 疫苗，由于技术不断改进，使得疫苗有了广泛的应用，被成功的用于许多细菌或病毒感染的防治，因此以疫苗来防治牙周炎也已成为一个重要思路。慢性牙周炎是一种细菌感染性疾病，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)是其主要可疑致病菌1。菌毛是 Pg 表面主要毒力因子之一，菌毛蛋白(fimbrillin，FimA)是其主要亚单位，能够介导 Pg 对宿主组织的粘附与入侵，以及与口内其他细菌的粘附共聚1-3，还能刺激炎性因子的产生4。多菌毛 Pg 野生型菌株可引起定菌大鼠牙槽骨吸收，而无菌毛的突变菌株则不会造成牙槽骨的破坏。也有实验
7、发现，用 FimA 免疫大鼠可减轻由 Pg引起的牙槽骨破坏5，将抗 FimA 的单克隆抗体用于口腔被动免疫，可以抑制该菌在口腔的定植6。因此，可以将 FimA 作为防治牙周炎疫苗抗原。Pg 菌毛的单体是 FimA，由单拷贝 fimA 基因编码。fimA 基因全长 1290bp，开放读框包括 1044bp，编码 347 个氨基酸。翻译后产物菌毛蛋白的功能域（如刺激 T 细胞和 B 细胞的位点、刺激细胞因子产生的位点等）位于氨基酸序列的31331aa 不等，各个位点之间可相互交叉或覆盖。近年来由于分子生物学和免疫学的发展，fimA 基因已被克隆和测序，对蛋白质分子中的各个功能区、抗原表位已有了更深
8、入的了解，为研制疫苗提供了可靠的依据。根据国内外研究进展，在前期已构建 fimA 原核表达质粒的基础上，本研究拟在大肠杆菌 BL21（DE3）pLysS 中表达 FimA 融合蛋白，并通过金属螯合亲和层析技术进行纯化，为后续实验制备抗 FimA 蛋白的多克隆抗体、研发用于人类的、可有效防治牙周炎的 DNA 疫苗提供实验基础。2 文献回顾牙周炎是口腔疾病中的常见病和多发病，在我国有很高的发病率7。牙周炎累及牙齿数目多，预后差，是造成牙齿缺失的主要原因。随着我国进入老龄化社会，牙周炎的预防将成为突出的保健问题。世界卫生组织已将牙周组织健康列为健康人的十项标准之一7。探索预防和治疗这种严重危害人类口
9、腔健康的疾病的方法，对于改善我国人民的口腔健康水平，提高人们的生活质量有着重要意义。3大量的实验研究、流行病学资料和临床观察表明7，牙周炎是菌斑微生物引起的感染性疾病。菌斑微生物是引发牙周炎的始动因子，是造成牙周组织破坏的必须因素。牙周菌斑中绝大多数细菌为口腔固有菌丛，对宿主无不良影响，仅少数细菌与牙周炎的发生、发展密切相关。其中牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis,Pg）是目前获得公认的一种牙周致病菌，它是牙周病，尤其是成人慢性牙周炎病变区或活动部位最主要的优势病原菌，而健康龈沟内很少7,8。目前牙龈卟啉单胞菌也是牙周微生物学领域重点研究的厌氧菌之一。除口腔疾病外，
10、在全身系统性疾病的研究中，血清学、动物模型、细胞培养的研究证实9-11Pg 感染与心脑血管疾病的发生有关，而且有学者报道12Pg的感染与低体重婴儿的分娩也有关。Pg 含有大量毒性因子，如蛋白酶、菌毛、脂多糖、血凝素等。其中菌毛在牙周致病作用中占据重要地位，而且与 Pg 在口腔的定植有关，为 Pg 的优势抗原之一。另外，因其具有广泛的生物学活性而成为牙龈卟啉单胞菌研究的一个热点。菌毛（pili，fimbriae）是位于革兰氏阴性菌 Pg 菌体表面的一种弯曲的、单股的丝状物，长 0.31.0m，直径为 3.55.0nm，遍布细菌表面，多者每菌可有数百根，由菌体表面伸向细胞外。其化学组分是一种蛋白质
11、，与细菌的运动无关。2.1 菌毛的致病机制 2.1.1 介导 Pg 附着于口腔Pg 附着于宿主组织表面是其定植于口腔的关键，也是其致病的先决条件。Pg 可选择性的直接附着于口腔内特定部位组织的表面，或识别已经附着在组织表面的细菌，然后间接的附着于组织表面。1）菌毛可介导 Pg 附着于口腔内各种组织细胞的表面菌毛可介导 Pg 黏附于龈沟液中的成分（如人血红蛋白和纤维蛋白原） ；唾液中的重要蛋白质成分（如富脯蛋白 PRP、富脯糖蛋白 PRG、富酪蛋白 PRT） ；乳铁转运蛋白，细胞外基质蛋白（ECM） （如玻连蛋白和纤维连接蛋白） 。人细胞外基质蛋白通过与 FimA 受体配体的结合在细胞外信号转导
12、中起重要作用。菌毛对基质蛋白有很强的亲和力，而且明显抑制玻连蛋白/纤维连接蛋白与其受体 3和配体 5（在中国仓鼠卵巢 CHO 细胞株中过度表达）的相互结合。在牙周组织中，菌毛可能通过细胞外基质蛋白受体/配体途径阻断细胞外信号转导。菌毛还可介导 Pg 黏附于牙龈上皮细胞、牙周袋上皮细胞、人口腔上皮细胞、人脐静脉内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞，附着并凝集人或羊的红细胞等。Umemoto13构建了无菌毛的 Pg 突变株，发现其对人口腔上皮癌细胞的黏附性和侵袭性均降低，接种小鼠后引起牙槽骨丧失的量也减少。其他学者构建了不表达菌毛的 Pg 缺陷株，发现它们黏附和侵袭人牙龈成纤维细胞14、上皮细胞15、内
13、皮细胞16和树突状细胞17的能力也降低，甚至不能黏附。这些研究结果说明菌毛在 Pg 黏附于口腔上皮细胞的过程中起重要作用。4此外，研究发现 Pg 可黏附于唾液覆盖的羟基磷灰石（hydroxyapatitecoatedwithsaliva，sHAP） ，这种黏附活动常被作为研究 Pg 与口腔内唾液覆盖的各种组织细胞黏附活动的模型。Lee18等的研究发现，Pg 与羟基磷灰石之间的这种黏附活动需要菌毛参与，而且抗菌毛的抗体能完全抑制这种黏附作用。学者们14,16通过同源重组技术灭活 fimA 基因后，发现突变株与sHAP 的黏附能力降低。这些研究结果提示 FimA 菌毛蛋白在 Pg 黏附到唾液覆盖的
14、口腔内各种组织表面的过程中起重要作用。2）在菌斑形成的早期，菌毛可介导 Pg 黏附于附着在获得性膜表面的细菌，间接的附着于组织表面细菌之间的相互黏附和共聚有助于早期生物膜的形成。链球菌是最先定植于牙齿表面的主要细菌，Pg 通过菌毛与链球菌细胞表面的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）高亲合力、高特异性的结合而与链球菌发生共聚，这种相互作用在 Pg定植于牙周袋的过程中可能起重要作用。此外菌毛还参与 Pg 与放线菌、福赛氏类杆菌之间的黏附过程。3）有关黏附机制的研究现在已经明确 Pg 黏附于口腔的过程为一种特异性识别过程，菌毛可能为特异性配体，与宿主细胞膜上的特异性受体相互作用7。部分 Pg 菌毛
15、可识别的黏附受体现已明确，如 integrins7,19、上皮细胞的细胞角蛋白 1420、巨噬细胞（MCs）上的 TLR2 和 CD147。菌毛通过上皮细胞的 integrins 促进 Pg与牙龈上皮细胞的黏附，抗 integrins 的抗体能抑制 Pg 的黏附和侵袭19。Pg 菌毛通过单核细胞上的 TLR2、CD14 和 CD11a/CD18，诱导外周血单核细胞 IL-6mRNA 的产生、细胞因子的分泌、p38 促有丝分裂蛋白激酶磷酸化和 NF-B 的活化。小鼠腹膜巨噬细胞的实验研究表明，2integrins（CD11/CD18）是小鼠腹膜巨噬细胞与 Pg 菌毛黏附的细胞受体；而且 链（CD
16、18）在信号转导中起关键作用。综上所述，菌毛可介导 Pg 黏附于龈沟液中的成分（如人血红蛋白和纤维蛋白原） ；人唾液成分（如富脯蛋白 PRP、富脯糖蛋白 PRG） ；乳铁转运蛋白、细胞外基质蛋白；宿主细胞（如牙龈上皮细胞、牙周袋上皮细胞、成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞，巨噬细胞等） ；口腔内的细菌（如链球菌、放线菌、福赛氏类杆菌） 。借助于菌毛黏附于这些物质，Pg 可在口腔内进一步定植、侵袭、诱导炎症反应的发生。2.1.2 引发炎症反应和免疫反应Pg 附着于口腔内组织细胞后，其抗原成分和毒性产物等可引发白细胞的趋化、吞噬等炎症过程，造成表面组织的损伤其中 Pg 菌毛能与脂多糖一起激活宿主的防御机制、诱导多种炎性细胞因子的产生；此外细菌及其产物还通过上皮细胞或者细胞间质进入表层下组织，在组织内繁殖，甚至扩散至全身。1）Pg 菌毛的白细胞趋化作用5牙周炎再现了一种重要的中性粒细胞介导的破坏宿主组织细胞的模型。牙周炎的优势病
