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1、二甲双胍抑制IL-6诱导的LNCaP增殖及上皮间质转化章国亮1，姜 庆1，江 军2 （400010 重庆，重庆医科大学附属第二医院泌尿外科1；400042 重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科2）摘要 目的 探索二甲双胍抑制前列腺癌发展的作用机制。方法 使用慢病毒感染构建IL-6过表达细胞株LNCaP-IL-6（IL-6过表达病毒转染）和LNCaP-ctr（空病毒转染），运用激光共聚焦扫描确定转染效果，ELISA检测LNCaP、LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr细胞IL-6分泌水平，倒置显微镜观察细胞形态。实验分为LNCaP-ctr组、LNCaP-IL-6组、LNCaP-ct
2、r+二甲双胍组和LNCaP-IL-6+二甲双胍组，MTT技术检测相对细胞数量，流式细胞技术检测二甲双胍对细胞周期的影响；Western blot检测LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr细胞TWIST和E-Cadherin表达水平。实验分为LNCaP-IL-6和LNCaP-IL-6+二甲双胍组，运用细胞迁移实验检测两组细胞迁移速度，Western blot技术检测两组细胞TWIST和E-cadherin表达水平。结果 激光共聚焦扫描和ELISA检测证明IL-6过表达细胞株LNCaP-IL-6构建成功，LNCaP-IL-6细胞IL-6分泌水平约为LNCaP-ctr的5 000倍。MTT实验显示
3、第5天LNCaP-IL-6相对细胞数量约为LNCaP-ctr的1.4倍，二甲双胍对LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr的抑制率分别为0.58和0.65，处理组的LNCaP-IL-6相对细胞数量约为LNCaP-ctr的1.6倍；流式细胞仪检测显示二甲双胍阻滞LNCaP的细胞周期为S期。细胞形态学观察和Western blot检测证实IL-6诱导LNCaP发生上皮间质转化，细胞迁移实验显示二甲双胍可抑制LNCaP-IL-6细胞的迁移，Western blot进一步证实二甲双胍降低LNCaP-IL-6 TWIST表达及升高E-Cadherin表达。结论 二甲双胍能够抑制IL-6诱导的LNCaP细
4、胞的上皮间质转化。关键词 前列腺癌；二甲双胍；上皮间质转化；LNCaP中图法分类号 文献标志码 A基金项目 国家自然科学基金（81172442/ H1619）；重庆市国际合作项目（2011GZ0047）通信作者 姜 庆，E-mail:；江 军，E-mail: Metformin inhibits IL-6 induced LNCaP proliferation and epithelial-mesenchymal transitionZhang Guoliang1， Jiang Qing1， Jiang Jun2 (Department of Urology , The Second Affi
5、liated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400010;Department of Urology , Daping Hospital/Institute of Surgery Research, The Third Medical University, Chongqing 400042) Abstratc Objective Detecting the mechanism by which metformin inhibits prostate cancer progression.Methods lentivirus
6、 transfection was used to construct IL-6 over-expressing LNCaP stable cell line（LNCaP-IL-6） and LNCaP control cell line（LNCaP-ctr）,Then laser scanning confocal microscope and ELISA assay was used to confirm IL-6 over-expressing LNCaP cell line; morphology of the cells was observed under inverted mic
7、roscope;The following experiments were carried out on the four groups:LNCaP-ctr，LNCaP-ctr with metformin，LNCaP-IL-6 and LNCaP-IL-6 with metformin.MTT assay was used to detect cell relative number,Flowcytometry was used to analyse the affection of metformin on cell cycle; wound healing assay was used
8、 to detect the invasive ability of LNCaP-IL-6 either with or without metformin. Western blot assay was used to detect E-Cadherin and TWIST expression level of LNCaP-ctr and LNCaP-IL-6，and the alteration of them after treated with metformin. Results Laser scanning confocal microscope scanning and ELI
9、SA assay attest that the construction of LNCaP-IL-6 is successful,the secretion level of IL-6 by LNCaP-IL-6 was 5000 the amount of LNCaP-ctr.MTT assay indicated that LNCaP-IL-6 relative cell number was 1.4 times the amount of LNCaP-ctr and in metformin treated group it is up to 1.6 times after cultu
10、red for 5 days，the inhibition rates of LNCaP-IL-6 and LNCaP-ctr are 0.58 and 0.65 respectively. Flowcytometry results indicated that metformin arrest LNCaP cycle in S phage .Morphology observation and western blot show EMT among LNCaP-IL-6 cells.Wound-healing assay proved that metformin inhibited LN
11、CaP-IL-6 migration .Western blot showed a decrease in TWIST level and a promotion in E-Cadherin level .Conclusion This study demonstrate that metformin reverses IL-6 induced LNCaP cell epithelial-mesenchymal transition .Key words Prostate cancer Metformin EMT LNCaP Supported by nature science founda
12、tion of China （81172442/ H1619）,and international cooperation projects foundation of ChongQing（2011GZ0047）.Corresponding author:Jiang Qing,E-mail: ；Jiang Jun,E-mail: 上皮间质转化是前列腺癌进展的重要机制之一。新近文献表明IL-6在前列腺癌的进展中起重要作用1。IL-6主要是以自分泌或旁分泌生长因子的方式促进前列腺癌的发展1，它还能够诱导乳腺癌、胰腺癌等多种癌细胞发生间质化（EMT）而使细胞获得侵袭和生存能力更强的表型2-3。二甲双
13、胍是治疗2型糖尿病常用的药物之一，具有潜在的抗癌作用，流行病学研究显示服用二甲双胍的糖尿病患者患癌风险低于未服药者，服用二甲双胍的癌症患者预后也好于未服用者6。二甲双胍被证明在体外能杀死多种癌细胞7-8。本研究通过构建IL-6过表达前列腺癌LNCaP细胞株(IL-6过表达病毒转染,LNCaP-IL-6），检测IL-6对LNCaP增殖的调节作用，结合细胞形态学观察和Western blot检测，证实IL-6诱导LNCaP上皮间质转化作用。用2 mmol/L二甲双胍处理LNCaP-ctr（空病毒转染）和LNCaP-IL-6，检测二甲双胍是否逆转IL-6诱导的LNCaP的增殖优势和上皮间质转化，探索
14、二甲双胍抗前列腺癌的可能机制。1 材料与方法1.1 材料RMPI1640培养基、胎牛血清、胰酶、PBS均购自Hyclone公司，慢病毒（pSB388 IL-6过表达慢病毒和pSB33对照病毒）购自上海生博医学生物工程科技有限公司，TWIST多抗购自Santa Cruz公司，E-cadherin购自Epitomics公司，ELISA试剂盒（CHE0009）购自北京四正柏生物科技有限公司，凝胶配置试剂盒（KPG113）和MTT试剂盒（KGA311）购自凯基公司。1.2 LNCaP细胞培养LNCaP细胞株由第三军医大学西南医院中心实验室提供，用含10%（体积分数）胎牛血清的1640培养基培养，孵箱培
15、养条件为37 、5% CO2.。1.3 IL-6过表达慢病毒感染实验取处于对数期生长的LNCaP细胞，培养瓶中细胞饱和度80%，胰酶消化后进行活细胞计数，调整细胞数为1105/mL，以2104/孔接种到24孔板。实验分为3组：IL-6过表达病毒组（pSB388）、对照病毒组（pSB33）、正常组。IL-6过表达病毒（pSB388）和对照病毒（pSB33）滴度分别为5.34108、1.22109 TU/mL，以MOI值为20计算，每孔加入的病毒数量为4105 TU。感染8 h后，弃上清，更换为新鲜培养基，400 L/孔，于第3天观察绿色荧光表达情况，出现绿色荧光表达后加入含2 g/mL飘零霉素的RMPI1640完全培养基对阳性细胞进行纯化筛选，以1 g/mL嘌呤霉素的完全培养基维持培养。将细胞依次转移到6孔板和培养瓶进行传代扩增并冻存细胞株。1.4 ELISA鉴定IL-6过表达LNCaP细胞株取处于对数期生长的LNCaP-IL-6、LNCaP-ctr和LNCaP细胞，胰酶消化后进行活细胞计数，调整细胞数为1105/mL，将细胞以5104/孔接种于24孔板，每种细胞设3个复孔。次日更换新鲜培养基，400L/孔，第3天收集上清做ELISA分析。标准品的稀释和加样：加入1.0 mL稀释液至冻干标准品中，待彻底溶解后，震荡混匀；准备7个干净的EP管,第1个EP管加入
