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1、第三节 三、微生物的培养技术,在实验室或在生产中，可采取何种方法来保证所需微生物的大量繁殖，或进而使其产生大量有益代谢产物。,问题：,一个良好的培养装置，应在提供丰富而均匀的营养物质的基础上，能保证微生物获得适宜的温度和对绝大多数微生物所必需的良好通气条件(只有少数厌氧菌例外)。 此外，还要为微生物提供一个适宜的物理化学条件和严防杂菌的污染等。,微生物的培养方法分为：,实验室培养,生产培养,液体培养,固体培养,厌氧培养,好氧培养,液体培养,固体培养,好氧培养,好氧培养,好氧培养,厌氧培养,厌氧培养,厌氧培养,实验室微生物的培养方法,好氧菌固体培养法,好氧培养,厌氧培养,厌氧菌固体培养法,好氧菌
2、液体培养法,厌氧菌液体培养法,试管斜面、平板、茄瓶,试管液体培养 浅层液体培养 摇瓶培养 台式发酵罐,高层琼脂柱法 厌氧培养皿法 亨盖特滚管技术 厌氧罐技术 厌氧手套箱技术,（一）好氧固体培养,1.实验室培养法,主要有试管斜面、培养皿平板及较大型的克氏扁平、茄子瓶等的平板培养方法。,茄子瓶,克氏瓶,克氏扁瓶（kolle flask）,试管斜面（test-tube slant）,培养皿琼脂平板（agar plate）,实验室培养法,（二） 厌氧菌固体培养,特殊的培养装置或器皿,配制特殊的培养基,实验室中 培养厌氧菌的条件,满足六种营养要素,加入还原剂和氧化还原势的指示剂,1、高层琼脂柱培养法 加
3、有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中，以培养相应的厌氧菌。在这种培养基中，越是深层，其氧化还原势越低，因而越有利于厌氧菌的生长。,2、厌氧菌斜面培养法,3、厌氧培养皿培养法 用于厌氧培养的培养皿有几种设计。有的是利用皿盖去创造一个狭窄空间，加上还原性培养基的使用而达到无氧培养的目的(例如Brewer皿，见图)；,水溶液在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出CO2 ，,有的则利用皿底有两个相互隔开的空间，其中之一放焦性没食子酸，另一则放NaOH溶液，待在皿盖平板上接入待培养的厌氧菌后，立即密闭之。经摇动，使焦性没食子酸与NaOH溶液接触，发生吸氧反应，从而造成无氧环境 。,水溶液在碱性条件下，能迅
4、速自氧化，释放出CO2 ，,4、厌氧罐(anaerobicjar)培养法 这是一种常规的不很严格的厌氧技术。在罐内一般可放10个常用的培养皿(直径9cm)或任何液体培养的试管。 厌氧罐的类型很多，但一般都有一个用聚碳酸酯制成的透明罐体，上有一可用螺旋夹紧密夹牢的罐盖，盖内的中央有一不锈钢丝织成的网袋，内放钯催化剂；罐内还放一含美蓝的氧化还原指示剂 。,使用时，先装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采用抽真空灌氮抽真空灌氮抽真空灌混合气(N2CO2H2=801010，V/V)。,罐内少量剩余氧在钯催化剂作用下，被灌入的混合气中的H2还原成水，从而造成很高的无氧状态。此时指示剂美蓝被还原成无色。
5、,厌氧培养罐,5、厌氧手套箱(anaerobic glove box)培养 这是50年代末问世的用于研究严格厌氧菌的重要装置。 箱内既可通过塑料手套进行种种操作，又可进行恒温培养。 箱体结构严密，箱内一般充以85N2、5CO2和10H2，同时以钯催化剂催化除O2，使箱内始终维持严格无氧状态。物件可通过有密闭装置的交换室进出箱体。,可用于海洋 厌氧微生物的研究,厌氧手套箱,6、亨盖特滚管培养法 (Hungate roll-tube technique) 1950年，美国著名微生物学家REHungate因分离瘤胃微生物和产甲烷菌等严格厌氧菌的需要而设计 。,主要原理是利用除氧铜柱来制备高纯氮，并用
6、高纯氮驱除小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和贮存，以及菌种的接种、培养、观察、分离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧条件下，从而保证了这类严格厌氧菌的存活。用这种方法制备成的培养基称为预还原无氧灭菌培养基。,将盛有融化的无菌无氧琼脂培养基试管放置于50左右的恒温水浴中，用1ml无菌注射器分别吸取10-5、10-6、10-7三个稀释度的稀释液各0.1ml于融化了的琼脂培养基试管中，而后将其平放于盛有冰块的盘中或特制的滚管机上迅速滚动，这样带菌的融化培养基在试管内壁立即凝固成一薄层。每个稀释度重复3次，而后置于37（酸奶样品42）恒温培养箱中培养。一般培养24-48h后，即可在厌氧管的琼
7、脂层内或表面长出肉眼可见的菌落。,亨盖特滚管技术,厌氧滚管培养法,亨盖特滚管技术,H-10菌株滚管培养后的菌落特征图,H-10菌株的菌体 形态图（1000）,亨盖特滚管技术,一般可通过增加液体与氧的接触面积或提高氧分压来提高溶氧速率，具体措施有： 浅层液体静止培养； 将三角瓶内培养物利用往复式或旋转式摇床 作 摇瓶培养 ； 在深层液体培养器的底部通入加压空气，并用气体分布器使其均匀、密集的微小气泡； 对培养液进行机械搅拌，并在培养器的壁上设置阻挡装置等。,（三）好氧液体培养,（三）好氧液体培养,1、试管液体培养 此法的通气效果一般均不够理想， 仅适合培养兼性厌氧菌。,2、三角烧瓶浅层液体培养
8、在静止状态下，三角瓶内的通气状况与其中装液量和棉塞通气程度对微生物的生长速度和生长量有很大的关系。 此法一般也仅适宜培养兼性厌氧菌。,,低温培养箱,通气培养海洋微藻,摇瓶培养海洋微藻,液体 培养法,3、摇瓶培养 即将三角瓶内培养液用8层纱布包住瓶口，以取代一般的棉花塞，同时降低瓶内的装液量，把它放到往复式或旋转式摇床上作有节奏的振荡，以达到提高溶氧量的目的。 此法是荷兰的AJKluyver等于1933年最早试用，目前仍广泛地用于菌种的筛选以及进行生理、生化和发酵等试验中。,恒温控温震荡培养箱,恒温控温震荡培养箱,4、台式发酵罐培养 体积一般为几升至几十升，并有多种自动控制和记录装置。现成的商品
9、种类很多，用作发酵研究十分方便。,优点：可根据微生物在生长过程中对碳源、氮源、生长因子等营养物质及温度、PH值、需氧量等条件的不同需要，合理配制，补加各种营养物质和随时调节温度、PH值和通风量。 可能把微生物培养过程的生长、代谢都控制在最佳状态而收到最好的培养效果。,液体深层培养,电动机,无菌空气,加料口,pH调节口,（四）厌氧菌的液体培养,放入厌氧罐或培养基中加入巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C或庖肉（牛肉小颗粒）等或有机还原剂的深层液体培养基，并在其上封以凡士林-石蜡层，以保证它们的氧化还原电位(Eh)达到-150mV-420mV的范围。 如果能将其放入前述的厌氧罐或厌氧手套箱中培养，则效果将
10、会更好。,生产性的微生物培养方法,好氧培养法,厌氧培养法,厌氧菌液体培养法,厌氧菌固体培养法,好氧菌液体培养法,好氧菌固体培养法,曲法培养,深层液体通气培养,堆积培养,液体静置培养,生产性的微生物培养实例,工业上常用大米、麸皮、米糠、谷壳、木屑等为基本原料，适当补充一些其他营养成分和水分，经灭菌后制成微生物培养基。固体培养基的特点是疏松，在培养基内部充满了空气，因此既可以静置培养，又可以通风培养.,啤酒发酵罐,牛奶、果汁发酵罐,在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含有菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状
11、态。,1、恒化连续培养 2、恒浊连续培养 3、连续发酵,（五）连续培养,1、恒化连续培养,以恒定流速使营养物质浓度恒定，从而保持细菌生长速率恒定的方法。 特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速率。 菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。 应用范围：实验室科学研究。,以恒定流速使营养物质浓度恒定,2、恒浊连续培养,通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。,原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。 当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。,恒浊连续培养,特点：基质过量，微生物始终以最高速
12、率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。,使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。,3、连续发酵,相对于单批发酵而言，连续培养用于生产实践上就称为连续发酵，就是将培养器放大为发酵用于产物或菌体生产过程。,缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月-1年。,优点：高效，简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作；便于利用各种仪表进行自动控制；产品质量稳定；节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。,微生物的扩大培养,现代的发酵工业生产规模越来越大，每只发酵罐的容积有几十立方米甚至几百立方米，要使小小的微生物在几十小时的较短时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。,菌种扩大培养的过程： 斜面菌种 一级种子培养 二级种子培养 发酵罐,微生物菌种扩大培养流程图,实验室菌种制备阶段 （一级菌种培养）,生产车间菌种制备阶段 （二级菌种培养、 三级菌种培养） 二级发酵 三级发酵,砂土孢子,冷冻干燥孢子,斜面孢子,摇瓶液体培养,茄子瓶斜面培养,固体培养基培养,一级种子罐,二级种子罐,发酵罐,饲料酵母一般生产工艺流程,
