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1、第 四 章 临床酶学检验技术,江苏大学基础医学与医学技术学院 姜旭淦,全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验 （第二版）,生物体内的酶（enzyme）是对其特异底物起高效催化作用的蛋白质和核糖核酸，前者是是机体内催化各种代谢反应最主要的催化剂。,2,酶的概念,3,目 录,4,第一节 酶学基本知识,5,6,7,8,（三） 酶 的 结 构,“非”必需基团,必需基团,结合基团：,催化基团：,活性中心：酶分子中直接和底物结合并起催化反应的空间局限（部位）,(Binding site),(Catalytic site),决定酶的专一性,决定酶所催化反应的性质,（活性中心）,酶的特性 （一
2、）高效催化性 （二）高度特异性 （三）可调节性 （四）不稳定性,9,10,绝对特异性(absolute specificity)：只能作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物 。 相对特异性(relative specificity)：作用于一类化合物或一种化学键。 立体结构特异性(stereo specificity)：作用于立体异构体中的一种。,11,一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物。酶的这种特性称为酶的特异性或专一性 。,12,对酶生成与降解量的调节 酶催化效率的调节 通过改变底物浓度的调节 多酶体系、关键酶（限速
3、酶）,13,酶促反应在温和条件下进行 加热、过酸、过碱、重金属都可以使酶活性降低（失活）,14, 改变 pH 急速 加热 加入 变性剂 加入金属鳌合剂 加入酶抑制剂 抑制剂 大量稀释,TCA Boiling SDS EDTA PMSF -,化学 物理 化学 化学 化学 物理,PMSF：Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟，用于抑制蛋白酶,15,添加物,作用,一般使用浓度,16,添加物,TLCK：对甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮 TPCK ：L-苯甲磺酰苯丙氨酰氯甲酮 Benzamidine 苄眯 -Mercaptoethanol：-巯基乙醇 Dithioth
4、reitol(DTT) ：二硫苏糖醇,17,酶在医学检验中的应用 举例,18,表示为： 底物：Subestrate：S 产物：Product：P 酶 ：Enzyme：E,19,酶促反应 - 中间产物学说,（一）米氏方程 1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反映的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程（Michaelis-Menten equation）。,20,（二）动力学参数 1.初速度(initial velocity)：在反应最初阶段底物的消耗量很小（一般在5以内）时的反应速度，用v0来表示 2.最大反
5、应速度(maximum velocity)：当酶的结合位点与底物结合饱和时的反应速度，通常用V或Vmax来表示 3.米氏常数（Michaelis constant，Km）：酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位同底物浓度,21,（三）Km在临床上的应用,（1）反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比。 （2）计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最大反应速度的百分率。当底物浓度为1020Km时，反应速度可达到最大反应速度的9095。 （3）根据Km值选择酶的最适底物。 （4）确定工具酶用量。 （5）确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依据。,22,（四）影响酶促反应的因素 1.底物浓度
6、对酶促反应的影响,（1）当SKm时，反应速率与底物浓度S无关，VVmaxK E，称为零级反应，反应速率与酶浓度E成正比。 酶学测定时一般底物浓度可选择为Km的1020倍。,23,底物浓度与Km比值相当的最大反应百分比,24,2.温度的控制,最适温度：不同酶类、反应条件 （1）Q10值：温度增加10，化学速度的变化率。酶的Q10值：1.5 2.5。 （2）使用37，是从实际工作方便来考虑。因为温度升高，反应速度快，灵敏度高。同时延滞时间和测定时间都可能缩短。从而有利于提高工作效率。但在37时，不可避免地一些酶可能失活。 （3）曾推荐25为酶测定温度，其优点为接近室温，反应体系温度很容易平衡到此温
7、度。但温度低，反应太慢。 （4） IFCC推荐的30，兼顾了上述二温度的优点，即保证了一定的反应速度，又无酶失活之扰。,25,常见酶温度转化系数,26,3.辅因子、活化剂的种类和浓度,辅因子（cofactors）:一种酶的活性所需要的一种非蛋白质成分。 （1）辅酶（Coenzyme）：NAD、NADP、ATP等，与酶蛋白结合很松弛，用透析和其它方法很易将它们与酶分开。在作用方式上和底物类似，在方法学上，将它们按底物处理。 （2）辅基 ： 是酶蛋白不可分割部分，转氨酶需要磷酸吡哆醛为其辅基。 显著特点之一是与酶结合需要一定时间，因此在酶测定时，先加入足量辅基，作用一定时间如10分钟后，再加入底物
8、开始酶反应。 （3）离子 很多酶需要特定离子帮助才能使其反应达到最大速度。最常见的是二价金属离子如Mg2+、Zn2+等。要选择合适的浓度。 （4）其它 如巯基化合物可稳定酶的双硫键。,27,4. 抑制剂,最常见的抑制剂：产物的抑制、底物的抑制，重金属及体液中的药物等造成的抑制。 抑制类型：可逆抑制、不可逆抑制。 去除抑制采取的措施：选用高纯度的原料、高纯净水、器材干净，在反应液中加入金属螯合剂，甚至可以引入一个副反应来去除产物的抑制作用。,28,5.缓冲液的种类、离子强度和pH,根据对酶活性的影响不同可将缓冲溶液分为活性、抑制、惰性三类。 各种体液样品也是缓冲液，应严格掌握测定样品与底物的用量
9、比例，样品在总体积中所占的比例应不超过10%。,29,四、酶促反应进程,1.延滞期 酶促反应开始至达到最大反应速度所需要的时间。 2.线性期 酶促反应速度保持恒定的时期，不受底物浓度的影响。 3.非线性期 随着反应时间的延长，底物消耗越来越明显，酶促反应速度明显下降，偏离线性而进入非线性期 。,30,延滞时间 测定时间,31,酶促反应时间进程曲线,浓 度 (C),酶偶联反应,32,Ex：待测酶 Ea：辅助酶 Ei：指示酶,酶 偶 联 反 应,1. 酶偶联反应有一个明显的延滞期。反应一开始只存在底物A，不存在指示酶的反应，随着产物B的出现和增加，指示酶反应随之加快，Ex和Ei反应速度相等，也就是
10、达到稳态。从酶反应开始至稳态期间，称为延滞期。 2. 在酶偶联法，无法直接求出A/t ，通过测定指示酶反应C（D）/t间接求出。要使酶偶联法测得的酶活性浓度准确可靠，则VindVx。换言之，指示酶的最大反应速度必须等于或接近测定酶的最大反应速度。 3. 用酶偶联反应测酶活性浓度时，最好条件应是测定酶反应为限速反应，动力学上为零级反应。指示酶为一级反应，酶反应速度与指示酶底物浓度相关。,33,34,第二节 血清酶变化的生理病理机制,一、血清酶的来源,（一）血浆特异酶：为血浆蛋白的固有成分，在血浆中发挥特定的催化作用。多数由肝脏合成并以酶原形式分泌入血，在一定条件下被激活，从而引起相应的生理或病理
11、变化。出凝血有关的酶或酶原、胆碱酯酶、铜氧化酶及脂蛋白脂肪酶等。 （二）非血浆特异酶： 外分泌酶：由外分泌腺合成并分泌进入血浆的酶，包括胰淀粉酶、胰脂肪酶、前列腺酸性磷酸酶等。血液中的含量与相应分泌腺的功能及疾病有关。 细胞内酶：存在于细胞内进行物质代谢的酶，随着细胞的不断更新或破坏可少量释入血液。当其大量出现于血清中时，提示酶的来源组织细胞受损，最常用于临床诊断。,35,二、血清酶的去路,（一） 血清酶的半寿期 (T1/2) 1. 定义： 酶失活至原来一半时所需时间。 2. 半寿期代表酶从血中清除的快慢。 半寿期长的酶，在血清中持续时间长。 （二）血清酶的失活和排泄 1. 酶的清除主要是在血
12、管内失活或分解。 2.肾小球滤过从尿液中排除 淀粉酶等。 3.网状内皮系统清除,36,三、血清酶的生理变异,（一）性别 少数酶如CK、ALP、ACP及GGT等有性别差异，与血清酶的来源组织有关。 （二）年龄 血清酶的活性随年龄而变化，ALP和GGT到老年时可有轻度升高。年龄差异也见于同工酶。 （三）进食 过量饮酒可使血清GGT明显升高。 （四）运动 多种血清酶活性升高，如CK、LD、AST、ALD和ALT等，其升高的幅度与运动量、持续时间、运动频率及骨骼肌所含的酶量有关。 （五）妊娠 胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热ALP、LD、LAP和ALT（少数）等，引起血清中这些酶活性升高。 （
13、六）其他 一些酶活性与体重、身高的增长、体位改变、昼夜变化及家庭因素有关。,37,四、血清酶变化的病理机制,1. 酶合成异常（1）合成减少 （2）合成增多 2. 细胞内酶释放增加 大多数血清酶增高的主要原因 （1）细胞内外酶浓度差异 （2）酶在细胞内定位和存在形式 （3）酶蛋白分子量的大小 3. 酶在细胞外间隙的分布和运送 细胞中的酶有三种途径进入血液。 4.酶的清除异常 当肾功能减退时，血中AMY活性升高，说明酶排泄障碍而导致在血液中滞留。另外胆道梗阻时，梗阻区ALP合成加强，同时ALP排泄受阻而逆流入血，造成血液中ALP升高。,38,39,第三节 酶含量的表示方法,一、酶活性浓度的单位 （
14、一）酶活性单位,1惯用单位 酶活性测定方法的建立者所规定的单位。由于单位定义不同，参考值差别很大，难以进行比较。 2国际单位（international unit，IU） 在特定的条件下，每分钟转化1mol底物的酶量为一个国际单位。,40,（二） 酶活性浓度 单位体积样品中的酶活性单位， 习惯用U/L来表示体液中酶活性即酶活性浓度 （三）正常上限升高倍数 （upper limits of normal, ULN)：用测得的酶活性结果除以参考范围上限,41,以mg/或g/来表示 优点： 1灵敏度高 灵敏度达到ng/至g/的水平。 2特异性高 测定的影响因素较少，几乎不受体液中激活剂、抑制剂的影响
15、，不受药物的干扰。 3可测定一些酶活性很难测定的酶。如不表达酶活性的酶原或脱辅基的酶蛋白或失活的酶蛋白。 4与酶活性测定一起，计算免疫比活性，有可能为临床应用提供新的资料和信息。 5在同工酶测定中的应用 与电泳法和层析法相比，免疫学法测定简单快速灵敏度高，标本量少，重复性好。与化学抑制法相比特异性好。,42,43,第四节 酶催化活性浓度测定的理论基础,（一）概念 将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，经过一定时间后，用终止液终止反应，通过化学或生物化学的方法测出底物或产物的总变化量，除以时间即可计算出底物消耗速度（dS/min）或产物生成速度（dP/min），将速度换算为mol/ mi
16、n便是以国际单位表示的酶活性。,44,45,定时法,无机P,酚,氨,萘胺,NAD(P)H,酮酸,淀粉,ALT、AST、LD,ALP、ACP、5NT,ALP、ACP,ADA、脲酶,CK、GGT,LD、GLD、G6PD,AMS,（二）定时法的方法设计,显色物,项目,（三）定时法（固定时间法）评价,定时法：测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产物变化的总量，计算酶促反应平均速度。 优点：比较简单，最后测定时因酶促反应已被终止，故所用仪器无需恒温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。 缺点：无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线性期。 利用该法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要非常精确，否则会引起较大误差。,46,（一）概念 将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，每隔一定时间（2s60s）连续测定酶促反应过程中某一
