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1、空肠弯曲菌检验,一、概述,空肠弯曲菌是弯曲菌属中的一个亚种，隶属于螺菌科。 已被认为是引起急性腹泻的重要原因菌。目前已证明为人畜共患病菌，人们食用受到该菌污染的食品和饮用水可引起急性肠炎。,空肠弯曲菌(C.jejuni),流行病学特征 家畜、家禽肠道正常菌群 传染源 病人，带菌者 ，带菌动物 传播途径 动物人 密切接触、粪口传播 人 人 粪口传播 人群易感性 人群普遍易感 15岁儿童发病率最高,所致疾病,1. 婴幼儿急性肠炎 腹痛、水样泻、粘液脓血便 2. 食物中毒,二、生物学特性, 形态与染色 本菌为革兰氏阴性多形态菌，螺旋 形，弯曲杆状。大小为（0.30.4）m（1.53）m，呈S形或纺锤
2、形，菌体一端或两端有单根鞭毛，长度约为菌体的23倍，在固体培养基上培养时间过久，如超过48h以衰老的球形菌居多。动力阳性。, 培养特性 初次分离时需要在含5%氧、85%氮和10%二氧化碳环 境中，传代后能在10%二氧化碳环境中生长，在多氧和绝对无氧环境中均不生长。 培养适宜温度为2543，最适温度为42，最适pH7.2。 对糖类既不发酵也不氧化，呼吸代谢无酸性或中性产物，生长不需要血清，从氨基酸或三羧酸循环获得能量。 在布氏肉汤中生长呈均匀混浊。 在血琼脂上，初分离出现两种菌落特征： 第一型菌落不溶血、灰色、扁平、湿润、有光泽，看上去像水 滴，边缘不规则，常沿划线蔓延生长；第二型菌落也不 溶血
3、，常呈分散凸起的单个菌落（直径12mm）、边缘 整齐、半透明、有光泽，呈单个菌落生长。当菌种传代后，如遇环境温度不适宜，易出现第二型。,（三）生化特性,弯曲菌属各个种的生化特性,注: +为90%以上阳性； d为有的阴性，有的阳性； （-）为一般不生长； -为90%以上阴性； ？为未知。,（四）抵抗力,本属菌抵抗力不强，易被干燥、直射阳光及弱消毒剂等杀灭，加热至58经5min可杀死。对青霉素、头孢霉素耐受，对红霉素、四环素、庆大霉素敏感。,（五）致病性,弯曲菌在胆管中生长，小肠上端微需氧环境中适宜本菌生存和繁殖，造成空肠、回肠和大肠组织损伤，通过肠粘膜侵入血液。空肠弯曲菌引起的病变主要在回肠和空
4、肠见斑块样炎症，伴有肠系膜淋巴结炎。,三、检验程序,四、操作步骤 1.样品的采集及处理 （1）肉类、乳类等可疑食品标本 先取10g检样于90mL生理盐水中，用电动搅拌器打碎，静置15min,将上清液以3000r/min离心10min，取沉渣做检验用，接种于Camp-BAP平板上，与4243微需氧培养48h，取出平板鉴定菌落。如1g样品菌量少于10个，此法不能检出。 （2）河水或污水标本 先取水样1000mL，经0.65m微孔滤膜过滤，再用0.45m微孔滤膜过滤。取滤膜培养于布氏杆菌肉汤中（含Camp-BAP抗菌剂），经微需氧424348h培养后，培养液做检验用，用Camp-BAP平板分离。 （
5、3）其他 不论哪种食物样品都应尽快交付检验。如果样品必须运送和保存，应当使用Cary-Blair氏半固体培养基。弯曲菌的存活时间取决于温度，在25情况下，其存活时间不到24h或更少，因此样品在原始分离前需放冰箱或冷处保存。,2.微需氧条件的制备 最佳微需氧条件是氧气5%、二氧化碳为10%、氮气为85%。微需氧条件的制备方法有很多种，例如常用的燃烛法、化学法、生物法、气袋法、仪器法等。 带有双相压力计的厌氧罐：在装入平皿密封后，先抽去罐内空气至负压为7.3104 Pa（550mmHg)处，同样输入上述气体至压力为零。即可放置恒温箱内培养。 3.分离培养 可直接在选择性培养基，如改良Camp-BA
6、P布氏杆菌培养基或Skirrow氏培养平板上划线接种。与42培养48h后，观察可疑菌落。 4.初步鉴定 将可疑菌落做氧化酶和过氧化氢酶试验，如为阳性，则涂片做革兰氏染色。根据菌落生长特征、菌体染色、动力（暗视野或相差显微镜下观察动力明显）、氧化酶和过氧化氢酶阳性者，可初步确定为弯曲菌。,5.确定试验 经初步鉴定后，仍需做下述试验，并且各项试验均应在5%氧气的微需氧环境中培养。 （1）甘氨酸耐受性试验 将分离培养所得可疑菌落接种于甘氨酸培养基中，培养48h，如为阳性，在培养基表面有云雾状生长，则为弯曲菌空肠亚种。 （2）硫化氢生长试验 将分离培养所得可疑菌落接种于TSL斜面上，并吊一根乙酸铅滤纸
7、条于管口，经4872h培养，空肠弯曲菌一般在斜面上少量生长，其反应为碱性/碱性（K/K），滤纸条变黑，但培养基底部不因硫化氢而变黑。 （3）马尿酸钠水解试验 将分离培养所得可疑菌落接种于马尿酸钠培养基，于42培养48h，离心沉淀取出部分上清液，加入三氯化铁试剂，如出现恒久沉淀物则为阳性，空肠弯曲菌呈阳性反应。,（4）35g/LNaCl耐受试验 将分离培养所得可疑菌落接种于含35g/L氯化钠肉汤培养基中，经48h培养，空肠弯曲菌不成长。 （5）42和25生长试验 将分离培养所得可疑菌落接种于两管布氏杆菌肉汤中，一管放在42下培养48h，一管放在25下培养48h，42生长而25不生长，则为空肠弯曲
8、菌。 （6）奈啶酸试验 将分离培养所得可疑菌落涂片于血平板上，然后贴上含有39m奈啶酸的滤纸于平板上，空肠弯曲菌敏感而肠道弯曲菌不敏感。 （7）TTC（2，3，5氯化三苯基四氮唑）试验 空肠弯曲菌在TTC培养基上呈阳性，而胎儿弯曲菌为阴性，阳性者有紫色菌苔并有光泽。 （8）硝酸盐还原试验 取培养物的浓菌悬液，在37放置2h，加入试剂观察颜色反应，以空肠弯曲菌呈红色的阳性反应。,6.生物分型 （1）快速马尿酸钠水解试验 （2）快速硫化氢试验 （3）DNA酶水解试验,空肠弯曲菌的生物分型,7.血清分型 空肠弯曲菌O因子分型应采用间接血凝法，H或K因子分型可用玻片凝集法。 8.菌种保存 空肠弯曲菌菌种应接种在改良Camp-BAP斜面培养基上（棉塞不宜过紧），于4243微需氧环境中培养48h后，置4冰箱中微需氧环境保存1014d，需要时仍可转种一次，长期保存需用冻干法，即真空冷冻干燥法。 注：在进行空肠弯曲杆菌检验时，应严格执行无菌操作，防止自身感染。,本节结束,
