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1、 山东大学实验报告 2014/11/4姓名：XX 系年级：2013级XX班 学号：201300XXXXXXX实验题目: 动物细胞培养 同组者: XXXXX动物细胞培养技术【实验目的】1. 学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2. 掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3. 学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4. 学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数，计算细胞存活率；【实验原理】（一）. 动物细胞培养技术动物细胞培养技术是指从动物体内取出组织或细胞，在体外模拟动物体内的生理坏境，在无菌，适当温度和一定的营养条件下，使之生存，生长和繁殖，并
2、维持其结构和功能的方法。细胞培养的意义:.具有其他生物技术无可比拟的优点；.培养条件易改变和控制，便于单因子分析；.便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；.在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用细胞培养的局限性：（1）.在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；(2).观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；(3).细胞培养得到的产物少。培养细胞的生存条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。细胞培养的方法：1. 原代培养：直接从生物体内获取细胞，组织或器官，进行体
3、外培养直至第一次传代为止。2. 传代培养：当培养的细胞增殖达到一定密度之后，则需要再做培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1:2或其他比例转移到另一个容器中的扩大培养。原代细胞培养的方法有：单层细胞培养法和组织块培养法细胞传代培养包括：贴附生长细胞的传代：洗细胞酶消化接种观察 悬浮生长细胞的传代：A.直接传代 B.离心传代单层培养细胞的生长过程分为：游离期，吸附期，繁殖期，维持期，衰退期培养细胞的形态分型：A. 贴附型 B.悬浮型（二）. 细胞死活鉴定细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异： 细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜
4、是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。 代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的
5、荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞膜内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲
6、蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。（三）. 血球计数板的使用血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(如图3)。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成(图4)。每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为
7、1400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l4000mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。图1 血球计数板的构造（a、平面图；b、侧面图）图Error! Main Document Only. 血球计数板网格的分区和分格【实验器材】1.超净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、眼科剪、眼科镊、培养皿、培养瓶、离心管、微量加样器、吸管、酒精灯；小鼠、培养基2.血球计数板、盖玻片、滴管、显微镜；培养的小鼠脾脏细胞、台盼
8、蓝、伊红【实验步骤】（一） 小鼠脾脏细胞的培养1）. 取材：取小白鼠一只，采用断头法处死，清水洗净小白鼠并浸于75%酒精中灭菌3min，取出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔，取出脾脏，去除周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1-2次，转入无菌玻璃培养皿中，待用。2）. 分离脾细胞：用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用L形针头注射器在皿内吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾脏长轴方向注射入脾内，用针尖在脾脏上扎眼，并用L形针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲洗脾脏并吹散挂出的脾细胞，稍微倾斜并静置1-2min，吸取上述静置后的脾细胞悬液上清
9、部分放入Eppendorf管，以3000转/分离心1-2min。3）.培养脾细胞：从超净工作台中区塑料培养皿一个，用“枪（1ml）”加入细胞培养液2ml，并在皿上做记号，待用。取上述离心后的Eppendorf管，在超净工作台内打开弃去上清液，用“枪（200l）”吸取塑料皿中的培养液400ul，加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ul脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37，5%的二氧化碳培养箱中培养。（二）. 台盼蓝法坚定细胞的死活1) 试剂配制：用生理盐水配置0.4%台盼蓝染液，备用。2) 细胞悬液制备：将生长有贴壁型细胞的培养瓶（皿）中
10、的培养液倒入干净试管中，向培养瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液1-2ml，静置3-5min，待见到细胞变圆，彼此不连接为止，弃去混合消化液并将上述试管中的培养液倒回培养瓶中，用滴管轻轻吹打细胞，制成细胞悬液。3) 染色制片：取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合，2min后制成临时装片，镜检。4) 染色结果：死细胞染成蓝色，活细胞不着色。（三）. 血球计数板进行细胞计数1) 染色计数：取上述步骤二所制备0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合2-5min，滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计
11、数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室（注意：不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加；在普通光镜10物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右）。2) 根据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：每毫升液体中细胞的数=每个大方格中的细胞数量*10000*稀释倍数【实验结果】从培养箱拿出的培养基在倒置显微镜下可以清晰的看到培养的细胞，细胞呈圆形，形状规则，聚集在一起，有立体感。10倍物镜40倍物镜经过台盼蓝染色后，死细胞的细胞膜因为没有了选择透过性，被染成蓝色 经过活细胞染色后，活细胞的细胞膜具有选择透过性，染
12、料不能进入细胞，所以细胞未被染成蓝色左上右上中间左下右下活细胞数53566死细胞数2626282529细胞总数3129333135细胞存活率=（5+3+5+6+6）/(31+29+33+31+35)*100%=15.72%每毫升液体中细胞的数：（31+29+33+31+35）*5*10000=7950000【实验结果分析】1. 培养基刚刚拿出来的时候是无色的，过了一段时间后变成粉红色2. 对于小鼠脾脏细胞的培养结果（1）.若所得的培养基呈现浑浊状态，则说明有杂菌的侵入。（2）. 若所得培养基没有明显的颜色变化，则很有可能培养基中未接入细胞或接入的细胞很少，细胞未生长繁殖。（3）。 若所得的培养
13、基透明度高，颜色微黄则证明细胞培养成功。3. 生长状态良好的细胞，细胞膜完整清晰，细胞质透明，颗粒状物质少细胞核区域明显。而死细胞含有空泡，颗粒状物质多，细胞透明度下降，没有立体感，核区域模糊，体积更大4. 活细胞边缘较明显，由于细胞膜仍然具有选择透过性，染料无法通过细胞膜，所以呈现透明无色5. 死细胞因为细胞膜已经失去选择透过性，染料进入细胞内，将细胞染色，且死细胞的边缘不明显。6. 本次实验，我们组所得的细胞存活率较低，分析原因可能是：无菌操作时实验操作不规范，导致细胞被破坏，影响了实验结果，也有可能是因为染色时间过长，细胞膜的通透性遭到破坏，部分细胞死亡。【实验注意事项反思】1. 对小鼠
14、进行消毒时，一定要严格进行，防止沾染杂菌，手也必须严格消毒。2. 严格进行无菌操作，防止杂菌污染，影响实验结果。3. 动物细胞培养使用的所有器皿、用具、溶液等必须经过严格消毒或除菌处理，才能进超净工作台中使用，整个实验过程都要有无菌操作的概念，操作在酒精灯附近进行，避免细胞被污染。4. 取小鼠脾脏细胞时要小心谨慎，既不能太用力将脾扎烂，也不能扎的太轻因为得到的脾细胞太少，起初我们组扎的很轻得到的细胞很少，给老师看过之后，重新扎脾脏，得到了较多的细胞。5. 在超净工作台进行操作时，实验刚开始时自己不留心将手臂伸进很大一部分，在老师训导之后才知道只需将手伸进很小一部分，不能将整个手臂伸进去以免造成
15、污染，带入杂菌.6. 注意染色的时间，时间太长可能会导致细胞膜的通透性遭到破坏，损坏细胞。7. 在用血球计数板技术时，计上不计下，计左不计右。8. 滴加细胞悬液时，应用滴管将悬液来回吹吸使搅拌均匀，以此避免计数时因为局部浓度太高导致多个细胞连结在一起，影响结果的观察。此外，计数时要十分谨慎，因为是要在计数的结果上乘以10000，即使是很小的偏差也会导致实验结果的大不相同。计数时对于连在一起的细胞要格外注意9. 做实验必须严格按照实验室的规定，注意无菌操作环境，按照老师的指令操作，这样才能使实验更精确的完成，取得较好的结果。此外，对于实验某些时间的精确把握也非常重要，时间的长短对于实验结果可能有较大的影响，日后一定要注意这一方面。【作业】1. 抑制肿瘤细胞增殖药物的筛选方法（1）. 应用结晶紫染色测定法筛选抗肿瘤药物结晶紫染色测定法是一种单层细胞培养的体外药物敏感性测定方法，其原理是结晶紫染色可通过细胞的特定摄生法而选择性的被细胞吸收，死亡的细胞几乎不吸收结晶紫染料，而被核吸收的结晶紫染料又可被有机溶媒提取，通过测定提取液的光密度值，就可测定活细胞的数量。近几年经过不
