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1、核技术： 能量的放大,计算机芯片： 信息的集成,20世纪自然科学的两大成就,PCR技术： 生命信息的放大,基因芯片： 生命信息的集成,20世纪生命科学的两大成就,PCR技术,朱晨兵,高考专题复习,多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。,1988年美国穆里斯（K.Mullis）等人发明，荣获1993年诺贝尔化学奖。,PCR,【基础知识】,一、PCR原理：,DNA复制：,半保留复制；,【基础知识】,一、PCR原理：,DNA复制：,半保留复制；,需要提供合成模板； 不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3-OH； 合成的方向都是53
2、。,DNA聚合酶,【基础知识】,一、PCR原理：,DNA复制：,半保留复制；,DNA的热变性原理。,Taq DNA聚合酶,耐高温。,【基础知识】,二、PCR条件：,胞内DNA复制与PCR技术的比较：,变性,Taq DNA聚合酶,DNA母链,dNTP,3个温度,Mg2+,缓冲对,连续复制,DNA,【基础知识】,二、PCR条件：,引物：,利用软件设计。,引物设计的原则：,决定PCR扩增产物的特异性和长度。,1.引物长度：,通常为2030bp，尽量降低引物与非扩增区的同源性；,2.引物内部不能存在部分互补序列；,3.两个引物之间不能存在部分互补序列；,4.引物的5端可以修饰，但3端不可以修饰：,如探
3、针标记。,例题 1,【2011年安徽】家蚕细胞具有高效表达外源基因能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可以提取干扰素用于制药。 采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。该PCR反应体系的主要成分应该包含：扩增缓冲液（含Mg2+）、水、4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、 和 。,对干扰素基因特异的DNA引物对,Taq DNA聚合酶,例题 2,【2011年江苏】请回答基因工程方面的有关问题： （1）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。,第一组： ； 第二组： 。,引物和引物局部发生碱基互补配对而失效,
4、引物自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效,（2）PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为 。,DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上,【基础知识】,二、PCR条件：,温度：,7075：,9095：,5560：,变性；,复性；,延伸。,【注意】,具体温度与DNA母链及引物中的G、C含量有关。,例题 3,【2008年江苏】回答下列问题。 （1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是 。 （2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种
5、类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？ 。,耐高温,引物对B,【基础知识】,三、PCR过程：,预变性；,复性；,延伸；,循环。,变性；,【2011年江苏】利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物中为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。 （1）从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占比例为 。 （2）在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。,15/16,三,例题 4,【拓展视野】,人教版选修3“利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知目
6、的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。”，怎样理解？,基因工程的第四步“目的基因检测与鉴定”中的基因探针如何获取？,【2011年北京】根据T-DNA的已知序列，利用PCR技术可以扩增出被插入的基因片段。如下图，从图中A、B、C、D四种单链DNA片段中选取 作为引物进行扩增，得到的片段将用于获取该基因的全序列信息。,B、C,例题 5,【拓展视野】,反向PCR：,【拓展视野】,不对称PCR：,用不等量的一对引物进行PCR扩增，产生大量特异长度的单链DNA。,制备基因探针。,【实验操作】,一、实验仪器：,二、设置对照：,【实验操作】,三、程序设计：,避免外源DNA的污染。,【实验操作】,多聚酶链式反应扩增DNA片段,【实验操作】,微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；,微量离心管在每吸取一种试剂都必须更换枪头；,所有的成分加入离心管后，盖严盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，离心10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。,四、操作提示：,【实际应用】,一、遗传疾病的诊断：,二、刑侦破案；,三、古生物学；,四、基因克隆：,五、DNA序列测定。,基因诊断；,【结果分析】,PCR检测,电泳,
