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1、1改良人源 LL作者：杨艳丽,葛晓冬,刘友生,邹佳【关键词】 人源杀菌肽 LLFusion expression and bactericidal activities of the reconstructed human cathelicidin LL37【Abstract】 AIM: To express and purify the reconstructed LL37 (rLL37) and study its bactericidal activity. METHODS: The DNA sequence of rLL37 was recombined with vector pET
2、30a（+）, and expressed in E.coli BL21 star (DE3) by the induction of IPTG, thus the 6His tagged fusion protein rLL37 was obtained. After the expressed product was purified by affinity binding chromatography with TALON resins, the product was certified by SDS PAGE, Western blot and cleaved by thrombin
3、 fector Xa. Then, by using high positive ion exchange column MacroPrep High S, we purified the cleaved product and collected the every elution peak. Finally, the bactericidal activity of the rLL37 was determined by the means of inhibitory zone. RESULTS: The DNA sequence of rLL37 was inserted into ve
4、ctor pET30a (+) and expressed in E.coli BL21 star(DE3). Gel scanning analysis showed that fusion protein accounted for 35% of total bacterioprotein. After the fusion protein was purified and certified by SDSPAGE, a single Mr 4000 strip may be found. Then, the rLL37 was proved by the means of inhibit
5、ory zone to be able to kill both Gramnegative bacteria and Grampositive bacteria. CONCLUSION: It is possible that the rLL37 is expressed in procaryotic cell by fusion and it possesses a strong bactericidal activity.【Keywords】 human cathelicidin LL37; fusion expression of protein; bactericidal activi
6、ty【摘要】 目的： 将改良 LL37多肽以融合肽形式表达、纯化，并初步研究其杀菌活性. 方法： 将编码改良的 LL37多肽的 DNA序列放入载体 pET30a（+） ，转入工程菌 BL21 star(DE3)中，用 IPTG诱导表达得到含 6His标记的改良融合蛋白 LL37. 再以 TALON柱芯亲和层析、SDSPAGE 和 Western blot鉴定后，用FXa裂解融合肽. 将裂解后多肽进一步用强阳离子交换柱 MacroPrep High S纯化、收集各洗脱峰, 脱盐、冻干. 采用抑菌圈法检测改良 LL37的抗菌活性. 结果： 改良的 LL37多肽于载体 pET30a（+）在杆菌 BL
7、21 star(DE3)中高效融合表达，用凝胶扫描显示融合蛋白的表达量约占全菌蛋白的 35. 融合蛋白经纯化后用 SDSPAGE鉴定在 Mr 4000处见单一条带. 经抑菌圈法检测改良的 LL37多肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有很好的杀菌力. 结论： 改良的人源性2LL37多肽以原核细胞进行融合表达是可行的，并具有较强的杀菌活性.【关键词】 人源杀菌肽 LL37；蛋白质融合表达；杀菌活性【中图号】 0引言人类惟一的 cathelicidin gene所编码的蛋白质为 hCAP18 (human Cationic antimicrobial protein 18), LL37是 Cthel
8、incidin蛋白 hCAP18 C端的 37个氨基酸片段,为 Mr 4.5103的阳离子两性分子 螺旋抗菌肽，其氨基酸残基序列为 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES1-2. LL37抗菌力较昆虫细胞源性抗菌肽的杀菌力弱. 最新分离出恒河猴的同源蛋白 RL37与LL37同源性很高,其净正电荷为+8,而 LL37为+5.8，RL37 的抗菌活性要高于LL373-4.根据 SAR （structureactivity relationship）研究显示所有 螺旋抗菌肽的抗菌活性和抗菌普与肽链中所带正电荷、疏水性氨基酸数目密切相关，通过分子改造增加 LL37肽
9、链中正电荷的氨基酸和碱性氨基酸数目，而不改变其 螺旋构象来提高其抗菌活性是一种较好的途径5-6. 本实验室对 LL37进行改良，将 Glu16,Asp26,Glu36分别替换为 Gln16，Asn26，Gln36，净电荷由+5.8 提高至+9. 经 PCR获得编码改良 LL37的 DNA全长基因片段，并且所设计的 DNA序列中其引导序列含有凝血因子 Xa酶切位点和带负电荷的承载蛋白. 我们通过构建适宜的表达载体、采用融合肽形式以大肠杆菌表达 rLL37，将其克隆到含有 6His的特异亲和纯化标志序列的表达载体 PET30a（+）中，从而在 E.coli中表达出能被正确切割产生有抗菌活性的融合蛋
10、白7-8.1材料和方法1.1材料 BL21 star菌、pET30a(+)，pMD18T 和鼠抗 6His mAb购自 ROCHE公司；DH5 菌由本研究所保存；Ex Taq，Sac，Hind，Fxa 裂解试剂盒购自TaKaRa公司；6His 亲和纯化 TALON柱芯及强离子交换柱芯 MacroPrep High S分别购自 Clontech公司和 BioRad公司；改良杀菌肽 LL37的 DNA序列为本所构建.1.2方法1.2.1rLL37多肽融合表达质粒的构建将本所已构建的改良杀菌肽 LL37的DNA序列经 17 g/L凝胶电泳、纯化，以连接试剂盒（TAKARA）连接入 pMD18T载体并
11、转入感受态 DH5a菌中，铺 LB板（含 Xgal 0.04 g/L，IPTG 0.024 g/L，Amp 0.1 g/L）进行蓝白斑筛选，测序正确的单菌落进行扩增、抽质粒，并进行双酶切（Sac及 Hind）和凝胶电泳、纯化. 纯化后的目的片段与同样处理的载体 pET30a+连接，转入 DH5a菌，铺 LB板（含 Amp 20 mg/L）进行抗性筛选，将单菌落进行扩增后抽提质粒、PCR 鉴定及测序鉴定.31.2.2表达条件及产物的亲和纯化将鉴定正确的融合蛋白表达质粒 PET30a(+)电转化入工程表达菌 BL21 star(DE3)，挑取 Kan抗性菌落，扩大培养于含 30 mg/L Kan的
12、 LB培养基中, 37振荡培养至 A600 nm为 0.60.8 时，加入 IPTG至终浓度为 1 mmol/L诱导表达 8 h，14 000 g离心 5 min收集菌体，超声破碎细胞包涵体，21 000 g 离心 20 min. 离心后上清可溶性蛋白经 TALON柱芯亲合纯化，沉淀包涵体蛋白经 6 mol/L的盐酸胍溶解后经 TALON柱芯亲合纯化，将可溶性蛋白及溶解后的包涵体分别以 5 mmol/L的咪唑洗涤杂蛋白，然后用 150,300,500 mmol/L的咪唑梯度洗脱目的蛋白，少量多次纯化,收集主峰，脱盐、冷冻干燥后得融合蛋白.1.2.3SDSPAGE、染色按分子克隆第三版进行，用蛋
13、白质银染液染色.1.2.4Western blot分析以抗 6His单克隆抗体为一抗、HRP 羊抗鼠 IgG单抗为二抗，并以 DAB显色.1.2.5溶合蛋白的 FXa裂解参考文献7的方法，将融合蛋白溶于 FXa裂解缓冲液中，加入 FXa，28保温 10 h.1.2.6rLL37多肽的离子交换纯化、分子量测定将 FXa裂解后的蛋白以强离子交换柱芯 MacroPrep High S进行梯度纯化，条件为：平衡液 10 mmol/L NaCl,洗脱 ABCD液分别为 220，350，500 及 1000 mmol/L NaCl，收集各洗脱峰，脱盐、低温低压冻干. 以 Folin酚法测定蛋白质含量，并进
14、行 SDSPAGE初步鉴定 rLL37的纯度，依靠蛋白质在电泳中的移动距离与其分子量的对数成反比的关系，测定蛋白质 Marker的各个条带的距离，与其分子量的对数建立一元线性方程，通过测定 rLL37的电泳移动距离，计算出 rLL37的相对分子量（Mr）.1.2.7用抑菌圈试验测定 rLL37多肽杀菌活性参照文献4-5的方法,将 15 g/L的底层营养琼脂培养基融化后取 10 mL倒入无菌平皿中，凝固后取 7 g/L的温度为 45的琼脂培养基 12 mL，加入对数生长期的细菌旋涡振荡终浓度（34）105 ，快速覆盖在底层胶上，凝固后在上层琼脂上打孔，把一定浓度的 rLL37多肽 10 L 滴入
15、孔中, 37孵育过夜. 抑菌活力以抑菌圈直径(mm)表示. 同时取生理盐水及 Amp，左氧氟沙星等作对照.2结果2.1rLL37多肽融合表达质粒的构建改良杀菌肽 LL37的 DNA序列成功转入表达载体 pET30（a+）中（图 1）. 抽质粒及 PCR鉴定目的片段分子量大小正确（图 2） ，目的 DNA序列经公司测序鉴定,证实 rLL37基因正确地接入 pET30a(+)质粒.图 1构建 rLL37多肽融合表达质粒流程图（略）22rLL37 多肽的融合表达重组的表达质粒电转化入工程表达菌 BL21 4star(DE3)中，挑选抗 Kan的阳性转化子经 IPTG诱导 8 h，经浓缩胶 40 g/
16、L, 分离胶 150 g/L SDSPAGE，蛋白质银染染色，在蛋白质 Mr约 15103处可见一条明显条带（图 3）. 用凝胶扫描显示重组融合蛋白的表达量约占全菌蛋白的 35. 重组融合蛋白主要以包涵体蛋白形式存在，少量以可溶性蛋白形式存在. 将可溶性蛋白和溶解后包涵体蛋白过 6His亲和纯化 TALON柱心，经 150 mmol/L的咪唑洗下一个宽大的 B峰，在 300 mmol/L的咪唑洗下一个较小的 C峰.图 2含目的片段质粒 pET30a(+)的鉴定（略）图 3rLL37在大肠杆菌中融合表达 SDSPAGE分析（略）2.3Western blot将 6His TALON亲和纯化收集的 B，C 峰蛋白脱盐、冻干后进行免疫印迹鉴定，B 峰在 Mr约 15103处可见一条染浅棕色条带，可证实B峰含有目的 LL37片段（图 4）.24rLL37 多肽的离子交换纯化将 6His TALON亲和纯化收集的 B峰用 FXa裂解后，经 MacroPrep Hi
